宮頸癌居全球女性癌癥死亡原因的第三位，在20 - 39歲女性癌癥死亡原因中居第二位。宮頸癌主要有兩種類型，其中宮頸鱗狀細胞癌（CSCC）占90%。手術、放療和/或化療是臨床上常用的治療方法。越來越多的證據表明，放療可以激活細胞毒性信號通路，促進癌細胞死亡，通常被用作CSCC的一線治療，特別是局部晚期病例。然而，放療的治療效率遠遠低于預期，宮頸癌特異性死亡率仍然很高，大約一半的局部晚期CSCC患者在放療后復發。因此，明確局部晚期CSCC的分子標記物，探索放療的作用機制，對于提高局部晚期CSCC的治療效果是必要的。單細胞核RNA測序（snRNA-SEQ）可以對隨時間累積的存檔冰凍組織進行分析，因此該技術可以對單個患者進行縱向分析。

snRNA-SEQ，RNA-SEQ

在本研究中，研究收集了配對的治療前和治療中的CSCC樣本，以便對治療相關的變化進行嚴格的分析。接下來，研究利用snRNA-SEQ對放療前和放療過程中主要細胞類型的動態變化進行了全面表征，從而闡明了與局部晚期CSCC放療反應相關的關鍵因素。接下來進一步收集了一個獨立的隊列，并進行了大量的Bulk RNA-seq來驗證snRNA - seq衍生的數據，即在局部晚期CSCC中與放療反應顯著相關的腫瘤細胞中neural-like progenitor （NRP） 程序的表達增加。這些發現能夠解釋放療治療的基本機制，還可能提供放療反應的潛在預測生物標志物以及新的治療靶點，可用于提高局部晚期CSCC患者對放療的療效。

1. 冰凍的人宮頸癌樣本放療治療前、治療中的snRNA-SEQ

本研究從11例患者中收集了19例新鮮冰凍樣本來做單細胞核測序，為了更好的描繪治療前和治療中單細胞核測序的時間動態變化，本研究收集了8例患者的治療前、中的樣本。去除低質量細胞核以后，19例樣本共獲得105364個高質量的細胞核。通過無監督聚類構建了細胞類型圖譜，并根據marker基因注釋出了7種主要的細胞類型（圖1a，c）。對治療前后細胞類型進行比較，發現治療后上皮細胞顯著降低（P<0.05），B細胞顯著增加（P<0.05）?？紤]到抽核相比于懸液，會捕獲到更多的實質細胞，所以本研究主要針對非免疫細胞進行研究。

2. 繪制放療過程中惡性細胞的分子變化

接下來首先對所有的上皮細胞進行inferCNV分析鑒定出了惡性腫瘤細胞。然后將來自所有樣本的35001個惡性細胞聚類成16個不同的亞簇（圖2c），發現惡性細胞主要通過患者進行聚類（圖2b）。研究發現，在T9、T12和T5亞簇內的一個細胞亞群中，含有豐富的干性相關基因的基底樣（BSL）程序的表達量顯著升高。相反，在T14、T10和T8亞簇的細胞中，富集了神經元發育/細胞遷移或粘附相關基因的NRP程序表達升高。接下來，研究評估來自MSig DB的hallmark基因集的表達，以確定惡性細胞的細胞狀態。發現來自T14、T10和T8亞簇的細胞中血管生成途徑（angiogenesis pathway）更高的表達，這有利于腫瘤的生長，同時，T9，T12，T5亞簇中與乏氧通路（hypoxia pathway）相關的基因表達量較高，與放射抗拒相關。放療被觀察到與譜系和細胞狀態程序表達的顯著差異有關。惡性NRP程序在治療中的表達顯著高于治療前樣本，而BSL程序的表達較低（圖2f）。值得注意的是，BSL、NRP、乏氧和血管生成4種惡性程序在無應答者治療前腫瘤的惡性細胞中高表達（圖2g），這表明它們在這些細胞類型中具有治療敏感性相關性。

3. 與放療相關的CAF亞群

本研究捕獲到了31530個癌相關成纖維細胞，并通過無監督聚類為了7個不同的cluster，包括1個抗原呈遞CAF （apCAF）、2個炎癥性CAF （iCAF）和4個肌纖維母細胞性CAF（myCAF）。研究觀察到放療后PI16 + iCAF （p = 0.04）的比例增加，放療反應較好的患者apCAF （p = 0.02）數量減少（圖3d）。接下來從SnRNA-SEQ的成纖維程序中挑選了4種，包括嗜神經性（NRT）、免疫調節（IMM）、肌成纖維細胞祖細胞（MYO）和粘附性成纖維細胞（ADH-F）程序用來確定這些亞群的功能表型。其中PI16 + iCAF在NRT和IMM程序中表達量最高，在MYO和ADH - F程序中表達量最低（圖3e）。然后，研究試圖探索炎癥相關的轉錄狀態是否與放療療效相關。發現，與治療中腫瘤相比，在治療前腫瘤的大多數CAF亞群中，炎癥相關通路，如干擾素、腫瘤壞死因子和白細胞介素6的表達顯著升高（圖3f）。此外，來自無應答者治療中腫瘤的CAFs比來自應答者的腫瘤具有更高的這些通路的表達水平（圖3g）。它們在宮頸癌的TME中具有炎癥調節作用，并與放療療效相關。

4. 放療背景下的細胞間相互作用

本研究利用iTALK鑒定惡性腫瘤細胞和其他細胞類型的細胞通訊關系，研究發現了與生長因子、細胞因子和NRP基因有關的細胞相互作用的改變。在細胞因子受配體對中，CAFs在NR中顯示出更多的與其他細胞類型之間的差異上調通信對（圖4a）。另外與治療前相比，在治療過程中觀察到更多的腫瘤細胞和其他細胞類型的NRP基因的配體和受體之間的相互作用（圖4a）。與有反應者相比，無反應者腫瘤中NRP基因的相互作用也更多（圖4b）。綜上所述，本研究結果表明CAFs與腫瘤細胞之間的細胞因子和NRP相關的細胞-細胞相互作用可能參與了放療誘導的反應，進而可能介導治療效果。

5.?NRP程序表達增加與不良結局相關

為了驗證以上結果，研究收集了第二個獨立的局部晚期CSCC患者隊列，其中包括來自17名患者（其中14例具有匹配的治療前和治療中的標本），進行了bulk RNA-seq。研究利用CIBERSORTx算法對帶有snRNA - seq細胞類型標簽的批量表達數據進行去卷積。結果顯示，snRNA-SEQ和bulk RNA-seq的結果在兩個時間點均呈顯著正相關（圖5a）。研究進一步計算了BSL和NRP方案在惡性細胞中的表達，以及NRT和IMM方案在CAFs中的表達（圖5b）。僅在2例治療前和8例治療中的腫瘤中成功檢測到NRP的表達（圖5b），表明放療與腫瘤細胞中NRP的表達呈正相關（圖5c）。值得注意的是，NRP在惡性細胞中的表達和IMM在CAFs中的表達在無應答者的腫瘤中顯著高于有應答者，這一發現驗證了NRP和IMM兩種程序的表達與snRNA - seq獲得的放療反應之間的負相關關系。盡管研究收集了兩個獨立的隊列，但樣本量仍然有限。因此，研究利用TCGA宮頸癌數據集，在一個更大的CSCC隊列中展示了患者預后與NRP和IMM表達之間的關系。Kaplan - Meier分析疾病進展時間（time to progression，TTP）和無病生存期（ disease-free survival，DFS）發現NRP和NRP + IMM高表達與較短的TTP和DFS （圖5e,f）相關。還發現只有NRP的表達與總生存期相關。

6. NRP關鍵基因NRG1作為放射敏感性調節因子的驗證

研究接下來的目的是評估NRP和IMM程序中與放療相關的關鍵基因在放療中的生物學功能。在NRP的200個基因中，發現與應答者相比，143個基因在無應答的惡性細胞中顯著上調。使用小干擾RNA （small interfering RNA，siRNA）敲低CSCC細胞系SiHa中NRG1的表達（圖6a）。通過細胞計數試劑盒（CCK-8）測定，NRG1敲除后細胞活力顯著降低，放射治療后下降程度更大（圖6b）。與此一致，克隆形成實驗表明NRG1下調后細胞集落數量減少，輻射暴露導致細胞集落數量減少更多（圖6c）。接下來在隊列3中探討了NRG1表達與CSCC患者放療反應及預后的相關性，根據免疫組化（IHC）發現治療后以及無響應的樣本中，NRG1表達量更高（圖6d，e）；生存分析表明，NRG1表達水平較高的患者總生存期和無進展生存率更差（圖6f）。

7. 圖7?IER3作為IMM的關鍵基因，其功能與放療療效的相關性

接下來，對放療前和放療中的FFPE CSCC樣本進行了多重免疫熒光（mIF）和IHC，以驗證隊列3中IMM程序中關鍵基因IER3的意義。首先在隊列3中通過多重免疫熒光（mIF）驗證了IER3在CAF中的存在（圖7a）。基于mIF，IER3+ CAFs的數量在放療后的腫瘤和無應答者中顯著升高（圖7b）。接下來使用IHC檢測隊列3中IER3的表達水平，與mIF的結果一致，IER3在放療后的腫瘤和無應答者中顯著升高（圖7c,d）。生存分析表明，IER3高表達與總生存期和無進展生存期較差相關（圖7e）。

參考文獻：

Lei Z ,Jun M ,Di Z , et al. Single-Nucleus Transcriptome Profiling of Locally Advanced Cervical Squamous Cell Cancer Identifies Neural-Like Progenitor Program Associated with the Efficacy of Radiotherapy.[J]. Advanced science,2023.