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導(dǎo)語
宮頸癌居全球女性癌癥死亡原因的第三位，在20 - 39歲女性癌癥死亡原因中居第二位。宮頸癌主要有兩種類型，其中宮頸鱗狀細(xì)胞癌（CSCC）占90%。手術(shù)、放療和/或化療是臨床上常用的治療方法。越來越多的證據(jù)表明，放療可以激活細(xì)胞毒性信號通路，促進(jìn)癌細(xì)胞死亡，通常被用作CSCC的一線治療，特別是局部晚期病例。然而，放療的治療效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于預(yù)期，宮頸癌特異性死亡率仍然很高，大約一半的局部晚期CSCC患者在放療后復(fù)發(fā)。因此，明確局部晚期CSCC的分子標(biāo)記物，探索放療的作用機(jī)制，對于提高局部晚期CSCC的治療效果是必要的。單細(xì)胞核RNA測序（snRNA-SEQ）可以對隨時間累積的存檔冰凍組織進(jìn)行分析，因此該技術(shù)可以對單個患者進(jìn)行縱向分析。
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研究技術(shù)
snRNA-SEQ，RNA-SEQ
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研究內(nèi)容
在本研究中，研究收集了配對的治療前和治療中的CSCC樣本，以便對治療相關(guān)的變化進(jìn)行嚴(yán)格的分析。接下來，研究利用snRNA-SEQ對放療前和放療過程中主要細(xì)胞類型的動態(tài)變化進(jìn)行了全面表征，從而闡明了與局部晚期CSCC放療反應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵因素。接下來進(jìn)一步收集了一個獨立的隊列，并進(jìn)行了大量的Bulk RNA-seq來驗證snRNA - seq衍生的數(shù)據(jù)，即在局部晚期CSCC中與放療反應(yīng)顯著相關(guān)的腫瘤細(xì)胞中neural-like progenitor （NRP） 程序的表達(dá)增加。這些發(fā)現(xiàn)能夠解釋放療治療的基本機(jī)制，還可能提供放療反應(yīng)的潛在預(yù)測生物標(biāo)志物以及新的治療靶點，可用于提高局部晚期CSCC患者對放療的療效。
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研究思路
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研究結(jié)果
1. 冰凍的人宮頸癌樣本放療治療前、治療中的snRNA-SEQ
本研究從11例患者中收集了19例新鮮冰凍樣本來做單細(xì)胞核測序，為了更好的描繪治療前和治療中單細(xì)胞核測序的時間動態(tài)變化，本研究收集了8例患者的治療前、中的樣本。去除低質(zhì)量細(xì)胞核以后，19例樣本共獲得105364個高質(zhì)量的細(xì)胞核。通過無監(jiān)督聚類構(gòu)建了細(xì)胞類型圖譜，并根據(jù)marker基因注釋出了7種主要的細(xì)胞類型（圖1a，c）。對治療前后細(xì)胞類型進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)治療后上皮細(xì)胞顯著降低（P<0.05），B細(xì)胞顯著增加（P<0.05）。考慮到抽核相比于懸液，會捕獲到更多的實質(zhì)細(xì)胞，所以本研究主要針對非免疫細(xì)胞進(jìn)行研究。
2. 繪制放療過程中惡性細(xì)胞的分子變化
接下來首先對所有的上皮細(xì)胞進(jìn)行inferCNV分析鑒定出了惡性腫瘤細(xì)胞。然后將來自所有樣本的35001個惡性細(xì)胞聚類成16個不同的亞簇（圖2c），發(fā)現(xiàn)惡性細(xì)胞主要通過患者進(jìn)行聚類（圖2b）。研究發(fā)現(xiàn)，在T9、T12和T5亞簇內(nèi)的一個細(xì)胞亞群中，含有豐富的干性相關(guān)基因的基底樣（BSL）程序的表達(dá)量顯著升高。相反，在T14、T10和T8亞簇的細(xì)胞中，富集了神經(jīng)元發(fā)育/細(xì)胞遷移或粘附相關(guān)基因的NRP程序表達(dá)升高。接下來，研究評估來自MSig DB的hallmark基因集的表達(dá)，以確定惡性細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)。發(fā)現(xiàn)來自T14、T10和T8亞簇的細(xì)胞中血管生成途徑（angiogenesis pathway）更高的表達(dá)，這有利于腫瘤的生長，同時，T9，T12，T5亞簇中與乏氧通路（hypoxia pathway）相關(guān)的基因表達(dá)量較高，與放射抗拒相關(guān)。放療被觀察到與譜系和細(xì)胞狀態(tài)程序表達(dá)的顯著差異有關(guān)。惡性NRP程序在治療中的表達(dá)顯著高于治療前樣本，而BSL程序的表達(dá)較低（圖2f）。值得注意的是，BSL、NRP、乏氧和血管生成4種惡性程序在無應(yīng)答者治療前腫瘤的惡性細(xì)胞中高表達(dá)（圖2g），這表明它們在這些細(xì)胞類型中具有治療敏感性相關(guān)性。
3. 與放療相關(guān)的CAF亞群
本研究捕獲到了31530個癌相關(guān)成纖維細(xì)胞，并通過無監(jiān)督聚類為了7個不同的cluster，包括1個抗原呈遞CAF （apCAF）、2個炎癥性CAF （iCAF）和4個肌纖維母細(xì)胞性CAF（myCAF）。研究觀察到放療后PI16 + iCAF （p = 0.04）的比例增加，放療反應(yīng)較好的患者apCAF （p = 0.02）數(shù)量減少（圖3d）。接下來從SnRNA-SEQ的成纖維程序中挑選了4種，包括嗜神經(jīng)性（NRT）、免疫調(diào)節(jié)（IMM）、肌成纖維細(xì)胞祖細(xì)胞（MYO）和粘附性成纖維細(xì)胞（ADH-F）程序用來確定這些亞群的功能表型。其中PI16 + iCAF在NRT和IMM程序中表達(dá)量最高，在MYO和ADH - F程序中表達(dá)量最低（圖3e）。然后，研究試圖探索炎癥相關(guān)的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)是否與放療療效相關(guān)。發(fā)現(xiàn)，與治療中腫瘤相比，在治療前腫瘤的大多數(shù)CAF亞群中，炎癥相關(guān)通路，如干擾素、腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素6的表達(dá)顯著升高（圖3f）。此外，來自無應(yīng)答者治療中腫瘤的CAFs比來自應(yīng)答者的腫瘤具有更高的這些通路的表達(dá)水平（圖3g）。它們在宮頸癌的TME中具有炎癥調(diào)節(jié)作用，并與放療療效相關(guān)。
4. 放療背景下的細(xì)胞間相互作用
本研究利用iTALK鑒定惡性腫瘤細(xì)胞和其他細(xì)胞類型的細(xì)胞通訊關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)了與生長因子、細(xì)胞因子和NRP基因有關(guān)的細(xì)胞相互作用的改變。在細(xì)胞因子受配體對中，CAFs在NR中顯示出更多的與其他細(xì)胞類型之間的差異上調(diào)通信對（圖4a）。另外與治療前相比，在治療過程中觀察到更多的腫瘤細(xì)胞和其他細(xì)胞類型的NRP基因的配體和受體之間的相互作用（圖4a）。與有反應(yīng)者相比，無反應(yīng)者腫瘤中NRP基因的相互作用也更多（圖4b）。綜上所述，本研究結(jié)果表明CAFs與腫瘤細(xì)胞之間的細(xì)胞因子和NRP相關(guān)的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用可能參與了放療誘導(dǎo)的反應(yīng)，進(jìn)而可能介導(dǎo)治療效果。
5.?NRP程序表達(dá)增加與不良結(jié)局相關(guān)
為了驗證以上結(jié)果，研究收集了第二個獨立的局部晚期CSCC患者隊列，其中包括來自17名患者（其中14例具有匹配的治療前和治療中的標(biāo)本），進(jìn)行了bulk RNA-seq。研究利用CIBERSORTx算法對帶有snRNA - seq細(xì)胞類型標(biāo)簽的批量表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行去卷積。結(jié)果顯示，snRNA-SEQ和bulk RNA-seq的結(jié)果在兩個時間點均呈顯著正相關(guān)（圖5a）。研究進(jìn)一步計算了BSL和NRP方案在惡性細(xì)胞中的表達(dá)，以及NRT和IMM方案在CAFs中的表達(dá)（圖5b）。僅在2例治療前和8例治療中的腫瘤中成功檢測到NRP的表達(dá)（圖5b），表明放療與腫瘤細(xì)胞中NRP的表達(dá)呈正相關(guān)（圖5c）。值得注意的是，NRP在惡性細(xì)胞中的表達(dá)和IMM在CAFs中的表達(dá)在無應(yīng)答者的腫瘤中顯著高于有應(yīng)答者，這一發(fā)現(xiàn)驗證了NRP和IMM兩種程序的表達(dá)與snRNA - seq獲得的放療反應(yīng)之間的負(fù)相關(guān)關(guān)系。盡管研究收集了兩個獨立的隊列，但樣本量仍然有限。因此，研究利用TCGA宮頸癌數(shù)據(jù)集，在一個更大的CSCC隊列中展示了患者預(yù)后與NRP和IMM表達(dá)之間的關(guān)系。Kaplan - Meier分析疾病進(jìn)展時間（time to progression，TTP）和無病生存期（ disease-free survival，DFS）發(fā)現(xiàn)NRP和NRP + IMM高表達(dá)與較短的TTP和DFS （圖5e,f）相關(guān)。還發(fā)現(xiàn)只有NRP的表達(dá)與總生存期相關(guān)。
6. NRP關(guān)鍵基因NRG1作為放射敏感性調(diào)節(jié)因子的驗證
研究接下來的目的是評估NRP和IMM程序中與放療相關(guān)的關(guān)鍵基因在放療中的生物學(xué)功能。在NRP的200個基因中，發(fā)現(xiàn)與應(yīng)答者相比，143個基因在無應(yīng)答的惡性細(xì)胞中顯著上調(diào)。使用小干擾RNA （small interfering RNA，siRNA）敲低CSCC細(xì)胞系SiHa中NRG1的表達(dá)（圖6a）。通過細(xì)胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）測定，NRG1敲除后細(xì)胞活力顯著降低，放射治療后下降程度更大（圖6b）。與此一致，克隆形成實驗表明NRG1下調(diào)后細(xì)胞集落數(shù)量減少，輻射暴露導(dǎo)致細(xì)胞集落數(shù)量減少更多（圖6c）。接下來在隊列3中探討了NRG1表達(dá)與CSCC患者放療反應(yīng)及預(yù)后的相關(guān)性，根據(jù)免疫組化（IHC）發(fā)現(xiàn)治療后以及無響應(yīng)的樣本中，NRG1表達(dá)量更高（圖6d，e）；生存分析表明，NRG1表達(dá)水平較高的患者總生存期和無進(jìn)展生存率更差（圖6f）。
7. 圖7?IER3作為IMM的關(guān)鍵基因，其功能與放療療效的相關(guān)性
接下來，對放療前和放療中的FFPE CSCC樣本進(jìn)行了多重免疫熒光（mIF）和IHC，以驗證隊列3中IMM程序中關(guān)鍵基因IER3的意義。首先在隊列3中通過多重免疫熒光（mIF）驗證了IER3在CAF中的存在（圖7a）。基于mIF，IER3+ CAFs的數(shù)量在放療后的腫瘤和無應(yīng)答者中顯著升高（圖7b）。接下來使用IHC檢測隊列3中IER3的表達(dá)水平，與mIF的結(jié)果一致，IER3在放療后的腫瘤和無應(yīng)答者中顯著升高（圖7c,d）。生存分析表明，IER3高表達(dá)與總生存期和無進(jìn)展生存期較差相關(guān)（圖7e）。
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參考文獻(xiàn)：
Lei Z ,Jun M ,Di Z , et al. Single-Nucleus Transcriptome Profiling of Locally Advanced Cervical Squamous Cell Cancer Identifies Neural-Like Progenitor Program Associated with the Efficacy of Radiotherapy.[J]. Advanced science,2023.
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