在自身免疫性疾病、慢性感染、移植排斥和癌癥中遭受慢性炎癥和抗原持久性的組織中發現了三級淋巴結構?(TLS)。腫瘤內 TLS 的存在和密度與許多癌癥類型的良好預后相關。

TLS 是在成纖維細胞網絡上形成的有組織的淋巴樣聚集體，包括一個 T 細胞區，其中成熟的樹突細胞與 T 細胞接觸，以及一個濾泡性 B 細胞區。在本篇文章中，解決了 TLS 作為 B 細胞原位成熟驅動因素、產生抗體 PC 的作用以及它們對 ICI 反應的問題。研究了腫瘤的空間轉錄組結構原發性透明細胞腎細胞癌 (ccRCC) 的微環境 (TME)。

新鮮樣本空轉轉錄組、石蠟樣本空間轉錄組、免疫組化技術、多重免疫熒光。

1. 空間轉錄組揭示了TLS+ 腫瘤中富含 B 細胞的熱點區域

作者利用10X Genomics Visium 空間轉錄組學技術對 24 個 ccRCC 原發性腫瘤（冷凍切片（n = 12）和 FFPE 切片（n = 12））進行空間轉錄組學測試。結果發現，Ca9是ccRCC腫瘤細胞的標志物，在大多數ccRCC腫瘤中的表達與23/24腫瘤中的表達一致，并且在腫瘤切片中分布均勻。使用微環境populations (MCP)-counter評估 TME 的免疫和基質細胞群的分布，該counter從轉錄組譜估計細胞類型豐度。在下圖所示的 ?TLS+ 腫瘤中，B 細胞和 T 細胞在TLS 區域中表達 。這些CD8 T細胞在腫瘤中低表達，在 TLS 區域略有富集。TLS 中的單核細胞分布較多，而 NK 細胞更廣泛地分布在整個腫瘤切片中。內皮細胞和中性粒細胞均勻分布，在 TLS 內分布較少。但成纖維細胞在 TLS 區域內分布較多。這些不同的 TME 空間組織模式在 8 個 TLS+ 和 4 個 TLS- ?冷凍切片腫瘤以及 10 個 TLS+ 和 2 個 TLS- FFPE 腫瘤中始終可以識別，這表明 TLS 與 B 細胞、T 細胞和成纖維細胞特征的表達有關。

2. Ig 和 B 細胞相關基因在 TLS中的顯著富集促使研究關注 B 細胞

通過對腫瘤區域和TLS區域的差異分析顯示，免疫細胞的基因表達和成纖維細胞基因表達組成了TLS區域的主要表達特征，Ig 和 B 細胞相關基因在 TLS 中的顯著富集促使研究關注 B 細胞。PC 相關基因 MZB1 的表達在 TLS 中高，而在冷凍切片腫瘤的腫瘤區域中總體低。由于 PC 的主要功能是產生抗體，于是分析了免疫球蛋白基因的空間表達。最終證實了成纖維細胞與 CXCL12、MZB1 與成纖維細胞以及 MZB1與 CXCL12 在距 TLS 一定距離處的共定位?？偨Y來說，在 TLS+ 腫瘤中，表達IGHG1 和 IGHA1的 PC 存在于 TLS 附近，并且可能隨成纖維細胞一起在腫瘤內遷移。

3. 空間B細胞受體（BCR）分析可識別原位超突變和克隆選擇

TLS 中 B 細胞成熟亞型和 PC 的共定位暗示了原位 B 細胞適應性免疫的產生。在此過程中，B 細胞會突變其 B細胞受體 (BCR) 序列，并選擇和擴增最親和的克隆。所以作者研究了 BCR 的核苷酸序列。因為Visium冰凍切片空間技術原理是基于芯片中不同spot點位上Bracode的RNA測序，這使得作者能夠查詢原始轉錄物并進行空間BCR分析。作者結合bulk RNA-seq數據發現TLS具有大量單一的輕鏈克隆型，突變的V基因轉錄本數量較少，多數突變序列轉錄本位于TLS遠端腫瘤區域。

4. TLS的漿細胞沿著成纖維細胞軌跡擴散

為了分析腫瘤內 PCs 和成纖維細胞的位置以及原位 CXCL12 的表達，作者利用多重免疫標記（IF），在遠離 TLS 的地方發現PC 沿著成纖維細胞軌道排列，嵌入在密集的 COL1+ CXCL12+ 成纖維細胞網絡中，從而證明它們在腫瘤床中的遷移。數據分析了 Ig 和成纖維細胞轉錄物的共表達，以及成纖維細胞轉錄物和 CXCL12 的共表達，并驗證了PC 在 TLS 內的位置以及空間轉錄組學確定的成纖維細胞網狀細胞 (FRC) 在空間上的位置。值得注意的是，在被 MUM1+ IgG+成纖維細胞軌道包圍的腫瘤巢中檢測到與腫瘤細胞結合的 IgG。

5. TLS and Ig-producing PCs 與結合到凋亡腫瘤細胞的 IgG 抗體和對免疫治療的反應相關

為了進一步研究 TLS、腫瘤內PC和Ig染色之間的聯系，首先分析了TLS成熟度。作者研究了 103 個腫瘤中 TLS 的存在與 PC 密度之間的相關性。發現含有 CD23+ FDC 網絡、BCL6+ 細胞和 PNAd+ HEV 的 TLS 與 ?MUM1+IgG+ PC 和 MUM1+IgA+ PC 密度之間存在很強的相關性。后面又進一步研究了 57 個 TLS+ 樣本上 TLS 成熟度標記與 MUM1+IgG+ 和 ?MUM1+IgA+ PCs 密度的相關性。

作者為了揭示腫瘤結合IgG抗體的功能，分析腫瘤細胞凋亡特征，結果顯示在IgG+腫瘤細胞＞60%的樣本中， Caspase 3活化的腫瘤細胞密度顯著升高。CD68+巨噬細胞與IgG+/cleaved caspase 3+腫瘤細胞距離更近。

腫瘤的三級淋巴結構（TLS）會影響癌癥免疫治療的效果。文章采用10x Genomics Visium空間轉錄組測序方法對冰凍切片和FFPE切片進行測序，鑒定腎細胞癌三級淋巴結構特征，以及漿細胞傳播途徑與腫瘤細胞Caspase3活化和免疫抑制劑治療應答的關系，揭示了前人未發現的在癌組織中B細胞對治療和預后的顯著意義，為未來腎細胞癌治療提供了思路。