Food Funct. | 中南大學湘雅公共衛生學院陳繼華團隊解鎖葉酸抗骨質流失新密碼

文章標題：Folic acid supplementation prevents high body fat-induced bone loss through TGR5 signaling pathways

發表期刊：Food & Function

影響因子：5.1

作者單位：中南大學湘雅公共衛生學院

百趣提供服務：16S測序、新一代代謝組學NGM 2

骨質疏松癥是由骨質流失引起的一種常見的全身性骨病，可導致骨骼脆弱，增加骨折風險，已成為一個重要的全球公共衛生問題。葉酸是一種B族維生素，具有調節脂質代謝和抗氧化能力等功能，但葉酸在骨質流失中的獨立作用仍然存在爭議。本文通過分析腸道菌群組成、代謝特征以及TGR5相關信號通路的變化，探討葉酸補充對骨質流失影響的可能機制，為預防骨質流失和骨質疏松提供新思路和實驗依據。

1.葉酸攝入量和總骨密度之間的關系可能由體脂率介導

利用2011-2018年NHANES人口數據分析葉酸攝入量與骨密度的關系。在排除了年齡小于20歲的人群并篩選了相關變量缺失較多的樣本后，最終樣本量為7551例（圖1B）。廣義非線性模型分析發現，葉酸攝入量每增加1 mg，總骨密度增加約0.007 g/cm²，由此推測出葉酸攝入量可能會影響總骨密度，從而影響骨骼健康。本文進一步分析了體脂率作為葉酸與骨密度(Bone Mineral Density, BMD)作用的中介因子，其中介效應占總效應的82.7%（圖1C）。因此，作者推測葉酸可能通過影響體脂率來影響骨骼健康。

為探索葉酸對體脂的影響，將小鼠分為四組（圖2A），分別是正常飲食組、正常飲食+葉酸組、高脂飲食組、高脂飲食+葉酸組。通過高脂飲食構建體脂率高的小鼠模型，并通過在飲用水中添加葉酸對相應組別小鼠進行干預。結果顯示，體脂率高的小鼠體重增加了2倍，體脂率增加了3.6倍。補充葉酸后，體重沒有顯著變化，體脂率下降了27%（圖2）。同時，體脂率高的小鼠血脂指標異常，補充葉酸能改善血脂異常。其中，總膽固醇(Total Cholesterol, TC)、甘油三酯(Triglycerides, TG)和低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)表現出與體脂率相同的趨勢（圖2D–G）。在體脂率正常的小鼠中，補充葉酸后未觀察到明顯異常現象。

3.補充葉酸可改善高體脂小鼠的骨質流失

微CT掃描和三維重建結果顯示高體脂率老鼠的股骨表現出明顯的骨破壞，而葉酸改善了骨質量（圖3A）；通過微CT計算的骨礦物質含量(Bone Mineral Content, BMC)也顯示出同樣的趨勢（圖3F）。小鼠股骨的HE染色顯示，高體脂率小鼠的骨小梁數量和體積減少，而補充葉酸使骨小梁數量和體積增加（圖3B）。小鼠股骨的抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-Resistant Acid Phosphase, TRAP)染色顯示，高體脂率小鼠的破骨細胞數量增加，而補充葉酸減少了破骨細胞數量（圖3C）。同時，骨形成標志物PINP和成骨標記蛋白RUNX2的變化趨勢與HE染色相同，骨吸收標志物CTX-1和破骨細胞標志物蛋白CTSK的變化趨勢與TRAP染色相同（圖3D、E、G）。

4.補充葉酸對腸道菌群組成的影響

小鼠糞便16S rRNA測序結果顯示不同組小鼠的腸道菌群組成存在顯著差異（圖4A-C）。維恩圖分析發現，四組小鼠之間存在5種差異腸道菌群（圖4D）。其中，嗜膽菌屬和玫瑰屬與能量代謝、脂質代謝、膽汁酸代謝密切相關。這表明補充葉酸可以改善腸道菌群的失衡，從而調節體內的新陳代謝。

5.補充葉酸對血清代謝物組成的影響

血清代謝組學分析表明，不同組間小鼠的代謝物存在顯著差異（圖5A）。維恩圖分析顯示，四組小鼠體內存在112種差異代謝物（圖5B）。對這112種差異代謝物的KEGG通路分析表明，它們參與了相關的代謝通路，包括蝶呤生物合成和膽汁酸生物合成（圖5C）。對參與相關代謝途徑的22種差異代謝物進行聚類熱圖分析，發現這些代謝物在四組間差異顯著，表明補充葉酸改善了高脂肪對這些代謝物的影響（圖5D）。

6.腸道菌群與代謝產物的相關性分析及機制推測

為了深入探究補充葉酸影響骨質流失的潛在機制，研究人員進行了腸道菌群與代謝產物的相關性分析，分別提取葉酸攝入量、體脂率(Body Fat Rate, BFR)和BMC進行網絡相關性分析，發現石膽酸(Lithocholic Acid, LCA)可能是葉酸攝入量與BFR之間的橋梁，進而影響BMC（圖6）。結合腸道菌群和代謝物分析的結果，推測膽汁酸代謝可能在這個過程中起重要作用。

本文研究發現，補充葉酸會影響體脂率高小鼠的LCA代謝水平（圖7B）。因此，本文推測補充葉酸可能通過影響LCA代謝，然后影響TGR5相關信號通路來改善骨質流失（圖7A）。小鼠股骨石蠟切片多色免疫組化結果顯示，高體脂率小鼠TGR5和RUNX2表達降低，CTSK表達升高。補充葉酸增加了TGR5和RUNX2的表達，降低了CTSK的表達（圖7C）。同時，本文檢測了TGR5和下游信號通路蛋白在小鼠股骨中的表達。體脂率高的小鼠TGR5表達降低，ERK和AMPK的磷酸化減弱，NF-κB的磷酸化升高。補充葉酸可逆轉這些蛋白質的表達（圖7D）。因此，補充葉酸可能通過調節LCA，進而調節TGR5及其下游途徑來改善骨質流失。

在20-60歲的人群中，葉酸攝入量與全身骨密度呈正相關，其影響可能由體脂率介導。同時，補充葉酸可有效減少高體脂率小鼠的骨質流失，主要通過調節脂質代謝，改善體內腸道菌群失衡和代謝紊亂。最明顯的是補充葉酸調節LCA的代謝，激活TGR5和下游信號通路，影響小鼠的骨形成和吸收過程，從而改善高體脂率小鼠的骨質流失。