IF=9.7! 中國環境科學研究院團隊：不同電荷聚苯乙烯納米塑料對斑馬魚的性別特異性神經毒性研究
英文標題：Life cycle exposure to differentially charged polystyrene nanoplastics leads to gender-specific particle accumulation and neurotoxicity in zebrafish (Danio rerio)
中文標題：不同電荷聚苯乙烯納米塑料的全生命周期暴露導致斑馬魚(Danio rerio)出現性別特異性顆粒積累與神經毒性
發表期刊：Environment International
影響因子：9.7
客戶單位：中國環境科學研究院
百趣提供服務：新一代代謝組學NGM 2 Pro、AQ700
研究背景
納米塑料(Nanoplastics, NPs)廣泛存在于淡水環境中，其光降解和物理、化學分解會導致塑料表面帶不同的電荷。目前，許多研究側重于評估生物體暴露于高濃度NPs后的毒性。在水生環境中，pH、離子強度和有機天然物質等特性會顯著影響NPs的聚集。盡管許多研究已經調查了NPs的神經毒理學，但仍然存在大量的研究空白，包括不同電荷的NPs對神經結構和功能的影響。雖然有研究表明不同電荷是影響NPs在生物體內積累和神經毒性的關鍵因素，但其在體內的潛在影響仍知之甚少。
本研究將斑馬魚(Danio rerio)暴露于與環境濃度類似的10 μg/L的不同電荷聚苯乙烯(Polystyrene, PS)納米塑料，其中PS不帶電荷，PS-NH2帶正電荷，PS-COOH帶負電荷。斑馬魚暴露培養120天后，研究人員通過光片顯微鏡三維成像、組織病理學、基因表達以及腦組織非靶標和靶標代謝組學檢測，研究不同電荷NPs對神經毒性、腦損傷和腦代謝的潛在影響。
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研究結果
2.1 不同電荷PS誘導斑馬魚腦損傷
本部分實驗共設置4個處理組，分別為對照組（CK，即未暴露納米塑料的ISO標準水環境）、未帶電聚苯乙烯納米塑料組（PS，暴露濃度10 μg/L）、氨基功能化聚苯乙烯納米塑料組（PS-NH2，帶正電，暴露濃度10 μg/L）、羧基功能化聚苯乙烯納米塑料組（PS-COOH，帶負電，暴露濃度10 μg/L），每組樣本量統一為6尾(n=6)。
將斑馬魚于暴露10 μg/L不同電荷PS培養120天后，研究人員發現斑馬魚腦發育的潛力受到抑制。與對照組相比，暴露于不同電荷PS對斑馬魚的體重、腦-體指數、腦損傷都有顯著影響（圖1）。
圖1 斑馬魚生長情況及腦組織H&E染色的組織學變化
同時，研究人員分析了暴露于不同電荷PS對腦超微結構的潛在影響，發現暴露于不同電荷PS后，細胞核超微結構、血腦屏障結構、線粒體結構等均出現損傷（圖2）。
圖2 暴露于不同電荷PS后，雄性和雌性斑馬魚大腦超微結構變化的代表性透射電子顯微鏡圖像
根據認知行為、抑郁樣行為、社會行為實驗結果，暴露于不同電荷的NPs對雌雄斑馬魚的神經毒性和認知、社交和情感行為也有顯著的影響（圖3）。
圖3 斑馬魚暴露于CK、PS、PS-NH2、PS-COOH后的神經行為
基于三維熒光顯微鏡成像，研究人員確定了不同電荷PS在雄性和雌性斑馬魚腦區的熒光分布（圖4A-B），并繪制了相關結構示意圖（圖4C）。對3D影像的統計分析顯示，雄性和雌性斑馬魚大腦網狀結構(Reticular Formation, RF)、下丘腦腹側(ventral hypothalamus, Hv)的熒光強度(Fluorescence Intensity, FI)都發生了顯著變化（圖4D-E）。雄性斑馬魚大腦中，PS-NH2和PS-COOH聚集在RF結構，而雌性斑馬魚大腦中，僅PS-NH2在RF結構和Hv中檢測到。這些結果表明，PS-NH2在斑馬魚大腦的RF和Hv中積累，并導致記憶和抑郁樣行為的異常表現。
10 μg/L PS或10 μg/L PS-COOH處理的雌性斑馬魚，其埃文斯藍染料(Evans Blue Dye, EBD)外滲明顯高于對照組，表明血腦屏障通透性明顯增加，結構和完整性均受到干擾（圖4F-G）。然而，不同電荷的PS似乎并沒有直接干擾雄性斑馬魚血腦屏障的完整性。
圖4 與對照組相比，不同電荷PS處理組的腦部三維熒光成像及血腦屏障通透性
雄性和雌性斑馬魚腦組織中神經炎癥因子和神經形成的相關基因的相對表達水平如圖5所示。與對照組相比，暴露于不同電荷PS對編碼生長相關蛋白(GAP)、腫瘤壞死因子(TNFa)和白細胞介素-13(IL-13)等基因表達水平有顯著影響。其中Mafbb的異常表達可能導致大腦出現明顯的炎癥反應。
圖5 不同電荷PS暴露后雄性(A)和雌性(B)斑馬魚腦中神經炎癥因子和神經發生相關基因的表達水平
2.2 斑馬魚大腦的非靶標代謝組結果
考慮到線粒體功能的重要性，研究人員通過非靶標代謝組學和靶標代謝組學確定可能受到影響的代謝途徑，確定不同電荷PS對全身代謝穩態的毒性機制，并進一步了解對線粒體的結構影響。
非靶標代謝組結果顯示，雄性斑馬魚大腦中，與對照或PS相比，暴露于不同電荷PS的代謝物發生顯著變化（圖6A-E）。
圖6 雄性斑馬魚大腦非靶標代謝組學分析
為了進一步了解這些代謝物的變化，對雄性斑馬魚大腦的差異代謝物進行了代謝通路分析（圖7）。與對照組相比，暴露于PS、PS-NH2、PS-COOH后，在精氨酸和脯氨酸代謝途徑以及丙氨酸代謝等方面存在明顯差異。維恩圖展示了暴露于不同電荷的PS后代謝途徑的差異（圖7F）。與PS相比，PS-NH2、PS-COOH暴露組表現出不同的代謝途徑。例如，PS-NH2暴露影響泛酸和輔酶A的生物合成、谷胱甘肽代謝和嘧啶代謝，而PS-COOH則影響硫胺素代謝途徑（圖7D-E)。
圖7 雄性斑馬魚大腦非靶標代謝組學通路分析
對雌性斑馬魚腦組織進行了相同的非靶標代謝組學分析，呈現出與雄性斑馬魚相似的代謝物變化模式（圖8）。此外，對雌性斑馬魚大腦的代謝通路也進行了分析，以確定暴露于不同電荷PS影響的關鍵通路（圖9A-E）。與對照組相比，氨基?；?tNRA生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等通路有顯著變化（圖9A-C）。與PS組相比，PS-NH2暴露對D-谷氨酰胺和D-谷氨酸的代謝、硫胺素、花生四烯酸等關鍵代謝通路產生了獨特的影響（圖9D）。PS-COOH誘導了與半胱氨酸和甲硫氨酸代謝相關的通路，組氨酸、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等通路發生了顯著變化（圖9E）。
這些發現表明，不同電荷NPs暴露擾亂了線粒體中許多重要的生物過程，導致認知、情感和社交行為受到顯著影響。
圖8 雌性斑馬魚大腦非靶標代謝組學分析
圖9 雌性斑馬魚大腦非靶標代謝組學通路分析
3 斑馬魚大腦的靶標代謝組結果
研究人員對斑馬魚大腦中的510種代謝物進行了靶標代謝組學研究。暴露于PS、PS-NH2、PS-COOH的雄性斑馬魚大腦分析顯示，只有一種代謝物減少：酪氨酸。與PS相比，PS-NH2和PS-COOH均導致羥基脯氨酸水平降低(圖10)。
圖10 靶標代謝組學分析的雄性斑馬魚差異代謝物火山圖
對于雌性斑馬魚，暴露于PS、PS-NH2、PS-COOH后，與對照組相比，艾托因和酪胺代謝產物水平顯著降低。此外，與PS相比，PS-NH2和PS-COOH暴露導致3-甲基硫丙酸水平顯著降低，肌酸水平顯著升高（圖11）。
靶標代謝組學結果表明，暴露在不同電荷PS環境下，斑馬魚大腦表現出許多失調的途徑，其中一些與氨基酸有很強的聯系。此外，斑馬魚大腦在暴露于不同電荷的PS后，與對照組相比存在性別特異性差異，還顯示與PS相比存在電荷特異性差異。
圖11 靶標代謝組學分析的雌性斑馬魚差異代謝物火山圖
研究結論
總的來說，將斑馬魚暴露于與環境濃度類似的PS條件下培養120天后，研究人員觀察到不同電荷NPs具有電荷特異性和性別特異性反應的神經毒性。暴露于PS、PS-NH2、PS-COOH誘導腦和線粒體損傷和炎癥反應。暴露于PS-NH2后，雌性斑馬魚大腦中出現了Mafbb、IL-4和IL-13的失調，RF區和Hv區NPs的積累明顯。重要的是，通過非靶標代謝組學分析，這些效應與雄性和雌性斑馬魚的不同生物學途徑有關。這項工作的發現增加了對脊椎動物如何在腦損傷和內源性代謝方面對不同電荷的NPs應激作出反應的理解，并直接為準確理解這些新出現的污染物對公眾和環境健康的風險提供了信息。
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END
張茗心 撰文
Winly 校稿