肺纖維化（Pulmonary fibrosis, PF），特別是特發(fā)性肺纖維化，是一種肺部組織被瘢痕替代、導(dǎo)致功能喪失的疾病。盡管其發(fā)病機(jī)制未完全明確，但近年來在分子病理機(jī)制上有所突破，推動(dòng)了尼達(dá)尼布和吡非尼酮等藥物的上市。這些治療方法能夠在一定程度上減緩病情發(fā)展，但它們通常伴有不良反應(yīng)，且無法實(shí)現(xiàn)根本治愈。為了深入研究肺纖維化的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新的治療方法，建立可靠的體外模型至關(guān)重要[1]。
TGF-β是一種多功能細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡。TGF-β與細(xì)胞受體結(jié)合后，激活Smad蛋白并調(diào)控基因，促進(jìn)纖維化，還能通過非Smad途徑（如MAPK）加速這一過程。在肺纖維化過程中，TGF-β通路被異常激活，使細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，形成肺疤痕。在特發(fā)性肺纖維化中，TGF-β通路的異常激活是纖維化進(jìn)展的關(guān)鍵因素之一[2]。近年來，利用TGF-β誘導(dǎo)肺相關(guān)細(xì)胞系和肺類器官纖維化模型，已成為研究肺纖維化的熱門方法。
提問：為什么選擇TGF-β誘導(dǎo)肺纖維化？
TGF-β建模 vs 傳統(tǒng)模型：肺纖維化研究中的優(yōu)勢對比
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對比維度 |
TGF-β建模 |
傳統(tǒng)模型（如博萊霉素、放射線、基因編輯） |
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機(jī)制特異性 |
精準(zhǔn)靶向纖維化核心通路（TGF-β/Smad信號通路），避免炎癥干擾 |
非特異性炎癥反應(yīng)[3]（博萊霉素）或單一基因功能研究（基因編輯） |
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實(shí)驗(yàn)可控性 |
TGF-β濃度、作用時(shí)間可精確調(diào)控，體外48小時(shí)即可誘導(dǎo)穩(wěn)定EMT表型[4] |
劑量和時(shí)間難以精確控制，表型不穩(wěn)定 |
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實(shí)驗(yàn)周期 |
造模周期短（＜1周） |
周期長（博萊霉素：2-4周；放射線：＞4周） |
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多通路交互模擬 |
激活Smad3、Col1a1等多靶點(diǎn)，模擬纖維化多通路交互[5，6] |
基因編輯模型僅聚焦單一基因，難以模擬多通路交互 |
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臨床關(guān)聯(lián)性 |
與COVID-19后纖維化、IPF等臨床病理高度關(guān)聯(lián)，動(dòng)態(tài)模擬局部或彌漫性纖維化[7] |
難以模擬病毒性纖維化（如COVID-19后纖維化） |
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數(shù)據(jù)可重復(fù)性 |
數(shù)據(jù)重復(fù)性高（>95%），結(jié)果一致性強(qiáng) |
數(shù)據(jù)波動(dòng)大，重復(fù)性較低（如博萊霉素模型的炎癥干擾） |
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操作難度 |
操作簡單，無需復(fù)雜設(shè)備 |
操作復(fù)雜（如放射線模型需特殊設(shè)備，基因編輯模型技術(shù)門檻高） |
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成本效益 |
試劑成本低，實(shí)驗(yàn)效率高 |
成本高（如基因編輯模型的構(gòu)建與驗(yàn)證費(fèi)用） |
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轉(zhuǎn)化價(jià)值 |
支持抗纖維化藥物篩選與機(jī)制研究，臨床前驗(yàn)證潛力大（如Cilengitide抑制劑）[8] |
轉(zhuǎn)化價(jià)值有限，難以直接應(yīng)用于藥物開發(fā) |
綜上，TGF-β造模因其機(jī)制靶向性、操作可控性及結(jié)果一致性，成為肺纖維化研究的優(yōu)選工具，尤其適用于信號通路解析和抗纖維化藥物開發(fā)。
TGF-β誘導(dǎo)肺纖維化實(shí)驗(yàn)流程
在體外纖維化造模的實(shí)驗(yàn)中，通常會(huì)選擇對TGF-β信號高度敏感的肺泡上皮細(xì)胞（如A549細(xì)胞系）或人胚肺成纖維細(xì)胞（HELF）。推薦采用2–10 ng/mL的TGF-β1進(jìn)行處理24–72小時(shí)，根據(jù)細(xì)胞響應(yīng)程度可以適當(dāng)調(diào)整濃度和處理時(shí)間，并對模型進(jìn)行鑒定和分析。
鑒定
（1）細(xì)胞形態(tài)：可以觀察到細(xì)胞從典型的鵝卵石狀上皮形態(tài)向梭形間質(zhì)形態(tài)的轉(zhuǎn)變；
（2）基因水平：使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)可檢測到上皮標(biāo)志基因E-cadherin的表達(dá)降低，以及膠原合成相關(guān)基因Collagen I/III（Col1a1/Col3a1）、α-SMA、Vimentin、結(jié)締組織生長因子CTGF的表達(dá)上調(diào)；
（3）蛋白水平：通過WB或ELISA對TGF-β信號通路的下游效應(yīng)蛋白如磷酸化Smad3（p-Smad3）、Collagen I、α-SMA以及炎癥相關(guān)因子IL-6、TNF-α進(jìn)行定量分析[9]。為了評估膠原沉積和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重塑，可采用羥脯氨酸（HYP）比色法測定膠原含量，并通過Masson三色染色或Sirius Red染色技術(shù)對膠原纖維進(jìn)行組織化學(xué)染色[10]。
體外纖維化模型鑒定指標(biāo)：Fibronectin、Collagen I、α-SMA[9]
使用 H&E 染色和 Masson 三色染色評估不同實(shí)驗(yàn)組的組織病理學(xué)變化和膠原蛋白沉積[10]
（4）功能學(xué)驗(yàn)證：通過Transwell滲透實(shí)驗(yàn)評估細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化，以及通過膠原凝膠收縮實(shí)驗(yàn)來證實(shí)肌成纖維細(xì)胞的收縮活性[11]。
（5）信號通路分析：通過Western blotting檢測p-Smad3與Smad3的比值來確認(rèn)TGF-β介導(dǎo)的經(jīng)典Smad信號通路的激活狀態(tài)，并探究絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑中的p38 MAPK和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）的磷酸化水平，以揭示非經(jīng)典信號通路的作用。
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產(chǎn)品數(shù)據(jù)
Measured by its ability to inhibit the IL-4-dependent proliferation of TF?1 human erythroleukemic cells. The ED50 for this effect is 4-40 pg/ml
下期預(yù)告：肝纖維化建模
參考文獻(xiàn)
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[2]Ong, C. H., Tham, C. L., Harith, H. H., Firdaus, N., & Israf, D. A. (2021). TGF-β-induced fibrosis: A review on the underlying mechanism and potential therapeutic strategies. European journal of pharmacology, 911, 174510.
[3]Yue, X., Shan, B., & A. Lasky, J. (2010). TGF-β: titan of lung fibrogenesis. Current enzyme inhibition, 6(2), 67-77.
[4]Kasai, H., Allen, J. T., Mason, R. M., Kamimura, T., & Zhang, Z. (2005). TGF-β1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition (EMT). Respiratory research, 6, 1-15.
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[8]Yi, M., Yuan, Y., Ma, L., Li, L., Qin, W., Wu, B., & Liu, B. (2024). Inhibition of TGFβ1 activation prevents radiation‐induced lung fibrosis. Clinical and Translational Medicine, 14(1), e1546.
[9]Liu, P., Miao, K., Zhang, L., Mou, Y., Xu, Y., & Wang, Y. (2020). Curdione ameliorates bleomycin-induced pulmonary fibrosis by repressing TGF-β-induced fibroblast to myofibroblast differentiation. Respiratory research, 21, 1-10.
[10]Li, S., Xu, A., Li, Y., Tan, C., La Regina, G., Silvestri, R., & Qi, W. (2021). RS4651 suppresses lung fibroblast activation via the TGF-β1/SMAD signalling pathway. European Journal of Pharmacology, 903, 174135.
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