ELISA實驗加入顯色底物后，標(biāo)準(zhǔn)品有顏色，但結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品最高點(diǎn)吸光值偏低或偏高、標(biāo)準(zhǔn)曲線無梯度等等，總結(jié)如下原因：
1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)吸光值偏高，超出儀器檢測范圍
ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)的吸光值一般在3.0以下，若太高超出儀器檢測范圍，顯示OVER FLOW，可能原因：
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序號
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可能原因
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解決方法
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|---|---|---|
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1
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如OD絕對值靠譜，
則顯色過度
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TMB顯色體系中建議根據(jù)S1，S2顏色進(jìn)行判斷，
當(dāng)S1，S2深藍(lán)色，有明顯梯度，S5有淡藍(lán)色時即可終止。 |
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2
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僅作單波長檢測
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由于參考波長讀取非特異性檢測，如指紋、劃痕、水漬等，
對結(jié)果也有影響。建議最終結(jié)果以雙波長為最準(zhǔn)確。 |
2、 標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)吸光值偏低
ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)的吸光值一般要在0.8以上，若小于0.8，可能的原因：
| 序號 |
可能原因
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解決方法
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|---|---|---|
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1
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粉末標(biāo)準(zhǔn)品
未充分溶解
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粉末標(biāo)準(zhǔn)品按說明書加一定體積的液體后，
輕柔混勻， 室溫靜置30分鐘，充分溶解。
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2
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標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融
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標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融后活性降低。
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3
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孵育溫度、時間
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按說明書要求孵育條件進(jìn)行孵育。
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4
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顯色時間控制
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TMB顯色體系中建議根據(jù)S1，S2顏色進(jìn)行判斷，
當(dāng)S1，S2深藍(lán)色，有明顯梯度，S5有淡藍(lán)色時即可終止。
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ELISA 實驗中標(biāo)準(zhǔn)品2倍倍比稀釋，但結(jié)果分析標(biāo)準(zhǔn)曲線沒有梯度，可能的原因：
| 序號 | 可能原因 | 解決方法 |
|---|---|---|
| 1 | 樣品或標(biāo)準(zhǔn)品污染 | 避免污染 |
| 2 | 錯誤的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋 | 完全按照說明書稀釋 |
| 3 | 偶聯(lián)抗體濃度過高 | 按照說明書調(diào)整到最佳的濃度 |
| 4 | TMB底物孵育時間過長 | 調(diào)整到合適的孵育時間 |
| 5 | 錯誤的孵育時間或溫度 | 完全按照說明書 |
| 6 | 孵育時未加蓋導(dǎo)致溶液揮發(fā)和污染 | 貼封片或加蓋 |
總結(jié)得到完美ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，需要注意幾點(diǎn)：
1、 充分溶解標(biāo)準(zhǔn)品；
2、 標(biāo)準(zhǔn)品避免反復(fù)凍融；
3、 梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品注意混勻。
聯(lián)科生物推薦：ELISA操作注意事項—標(biāo)準(zhǔn)品溶解稀釋。