1. 在每個流式上樣管中加入 100 μl 準備好的細胞懸液，細胞數約為 1x10^6 個。
2. 按照細胞表面抗原染色方法標記表面抗原。按照說明書加入適量的 CD4 和 CD25 抗體。4 ℃孵育30 分鐘。
3. 用預冷 PBS 洗滌細胞，離心去上清。
4. 用 3 倍體積的固定/破膜稀釋液（#ICD01） 稀釋 固定/破膜濃縮液（#ICC01），制成固定/破膜工作液，注意要新鮮配制，每管的用量為 1ml。
5. 旋渦震蕩重懸細胞后加入 1ml 的固定/破膜工作液（1:3 稀釋好），并再次旋渦混勻。
6. 避光 4℃孵育 30 分鐘。
7. 將破膜緩沖液（#ICB01）用去離子水 1:9 稀釋，制成破膜緩沖液工作液。每管的用量為 8.5ml。
8. 加入 2ml 破膜緩沖液工作液（1:9 去離子水稀釋），離心洗滌細胞并棄去上清液。
9. （可選）用 100ul 破膜緩沖液工作液重懸細胞，加入 2μl Anti-Mouse CD16/CD32 (2.4G2), Purified（#AM016）進行阻斷，室溫避光孵育 15 分鐘。
10. 無需洗滌，加入 Foxp3 抗體或 PE Rat lgG2a 同型對照（用破膜緩沖液工作液進行稀釋），避光 4℃孵育至少 30 分鐘。建議進行預實驗摸索出抗體的最適濃度。
11. 加入 2ml 破膜工作液離心洗滌細胞并棄去上清液。
12. 用適量體積的 Flow Cytometry Staining Buffer 重懸細胞，并上機檢測并分析。
注：由于染色過程中使用了細胞固定和破膜，對比起活細胞在形態上會有一定變化，因此 FSC/SSC 圖中圈門時需要做一定調整。
以上步驟僅供參考，以廠家說明書為準。