在癌癥發展的過程中，原發性腫瘤細胞可能通過血液或淋巴系統遷移到身體其他部位形成新的腫瘤，即繼發性腫瘤（轉移瘤）。相較于原發性腫瘤，繼發性腫瘤基因突變高度保守，可塑性顯著增強，可適應多種生存環境，并對現有的包括化療、靶向治療和免疫治療在內的全身治療方法產生抗性，最終導致患者死亡。

結直腸癌（CRC）是全球第二大癌癥死亡原因，約有 20-50% 的局部結直腸癌患者在初始治療后進展為 IV 期轉移性疾病，并有約 30-40% 的患者在接受原發性腫瘤切除手術后出現了轉移。常用 CRC 研究模型中，體外腫瘤細胞系缺乏親本的病理學特征和異質性；動物模型成本高、通量低、差異性大；而來源于患者腫瘤組織的類器官則因保留有原始腫瘤的遺傳和形態特征以及結構功能備受研究者青睞。2020 年 9 月，復旦大學團隊首次培養出 CRC 肝轉移的類器官模型（參考資料 [2]）；2022 年 9 月，基于 CRC 肝轉移的類器官生物庫也已經構建（參考資料 [3]）。

2024 年 10 月 30 日，美國斯隆-凱特琳癌癥中心 Dana Pe’er 及 Karuna Ganesh 團隊在期刊 Nature 發文 “Progressive plasticity during colorectal cancer metastasis”。

本研究使用來自同一患者的三種組織樣本，發現繼發性腫瘤耗盡腸干細胞 ISC，走向復雜的非典型基因表達，并因此擁有更強的可塑性。此外，使用類器官模型，研究團隊檢測出可實現阻遏轉移表型發展的重要因子 PROX1，為 CRC 轉移瘤的病理機制研究與臨床治療提供了新線索。

（來源：參考資料 [1]）

臨床上，應對結直腸癌常采用同期切除手術，將正常腫瘤、原發性腫瘤和繼發性腫瘤（常見轉移灶為肝臟）一同切除。研究團隊繼而觀測到，這三種組織涵蓋了腫瘤從發生到轉移的全過程，可作為機理探索的良好樣本組，因此首先采用單細胞 RNA-seq，對來自同一患者的三種組織樣本間的差異性特征進行了鑒定。

主成分分析 PCA 顯示，三種樣本間最大的差別來自于 LGR5⁺ 腸干細胞 ISC 特征。

在正常組織中，ISC 會在保持自我更新的同時分化生成多種子細胞，包括腸內分泌細胞、潘氏細胞、杯狀細胞等分泌譜系，以及負責吸收的腸道上皮細胞等。與此同時，ISC 也被廣泛認為是大部分結直腸癌的起源細胞。研究人員發現，相對于正常分化的結腸組織而言，腫瘤細胞表達更高水平的 ISC，反應腫瘤組織擁有更強的潛在分化能力。

而將腫瘤細胞與正常組織中的 ISC 進行對比，則發現了更細分的基因表達上調，包括 WNT 信號傳導基因（LGR5、EPHB2、ASCL2、TCF7）、胚胎發育基因（BMP7、SOX4、CYP2W1）和應激反應基因（UPR1、MTORC1）等。

圖1：不同組織樣本中 ISC 水平的差距

（來源：參考資料 [1]）

在腫瘤細胞內部，繼發性腫瘤則表現出了比原代腫瘤更低的 ISC 水平；其間，接受過化療的繼發性腫瘤 ISC 水平最低。未經治療的原發性腫瘤的轉移過程理論上伴隨 ISC 的分化，因此在轉移性腫瘤中，ISC 樣細胞最終被耗盡。

圖2：所有腫瘤細胞中 ISC 水平

（來源：參考資料 [1]）

整體而言，正常腸道細胞根據細胞類型的不同嚴格表達特異性基因。而腫瘤細胞的內部細胞特征混亂，可能在同一個細胞中共表達吸收、分泌以及 ISC 特異性基因。這種大批量混雜的譜系特征也反饋出腫瘤細胞內腸道生理層次的失調和腫瘤特異性程序的獲得，與其他癌癥中的結果保持一致。

圖3：正常腸細胞（上對角線）和未經化療的腫瘤（下對角線）中的基因-基因相關性

（來源：參考資料 [1]）

在初步鑒定三種樣本內部基因表達的差異之后，研究人員使用 Hotspot 對腫瘤細胞進行注釋，將鑒定得到的 37 個基因程序歸類為 10 個模組。其中包含 4 個正常腸道細胞可能會表達的典型基因模組，分別是 ISC 樣（LGR5，ASCL2），分化后的吸收（FABP2，KRT20）和分泌（TFF3，TFF1）型腸道細胞表型；

以及另外 6 個非典型的基因表達模組。其中，損傷修復模組（L1CAM，EMP1，TACSTD2、CD70和OSMR）與腫瘤再生以及轉移瘤的治療抗性緊密相關。L1CAM 在早前報道中已被確認為結直腸癌轉移起始細胞的標志物。

另外兩個模組與損傷修復緊密相關，其中一個表達上皮間質轉化 EMT / 膽管上皮細胞標志物（CDH2, Vim），一個表達內胚層發育基因（WNT5B, BMP4）。

值得注意的是，有 3 個模組表達與分化的非腸道細胞狀態相關的基因，它們分別表達鱗狀細胞樣（KRT5, ELF5）、神經內分泌細胞樣（NEUROD1, CHGB）和成骨細胞樣（MSX1, DLX5）譜系。盡管正常結腸組織中也會含有一定量的腸內分泌細胞，但比之腫瘤細胞，其缺少腸轉錄因子 CDX1 和 CDX2 ，且其豐度遠不如腫瘤細胞富集。另外，在本次受試的 CRC 患者中，鱗狀樣和神經內分泌樣模組普遍存在，水平不同。

整體看來，腫瘤細胞中，腫瘤 ISC 樣、損傷修復、 EMT 和內胚層模組傾向于組合共表達；如吸收等分化度更高的模組則傾向于細胞特異性表達。這也顯示出腫瘤細胞內部的失序，與其保留有的部分正常分化細胞的嚴格基因表達的特質。

圖4：所有 CRC 腫瘤細胞的基因注釋結果

（來源：參考資料 [1]）

關注到原發性腫瘤細胞在轉移過程中失去腸譜系身份、轉化為非典型身份的重要性，研究團隊其后使用多重免疫熒光分析將細胞可視化，并在蛋白質水平上對相關標記物進行了檢驗。

結果顯示，原發性腫瘤仍然保留有限定轉錄因子 CDX2 這一腸譜系特征的表達；而轉移瘤中，分化相關腸標志物 CK20 及 ISC 標志物 OLFM4 下調，損傷修復標志物 TR0P2 中幅度上調，再度印證了其腸譜系身份的喪失。

圖5：三種組織樣本中，典型與非典型標志物的免疫熒光染色結果

（來源：參考資料 [1]）

此外，相較于原發性腫瘤，轉移瘤中非典型表達細胞占比更高。這一結果在此前研究中也得到了驗證。此外，鱗狀樣和神經內分泌樣等非典型基因表達也在未經治療的患者中檢出，指示治療并非進入非典型狀態的先決條件。不過化療可能影響轉移瘤中非典型模組的表達水平。

總而言之，相較于正常組織，腫瘤細胞擁有更高的 ISC 表達水平以及更混亂的共表達譜系。腫瘤細胞當中，繼發性腫瘤失去腸譜系身份，產生更多的非典型基因表達，過程中 ISC 特征被耗盡。

接下來，研究人員試圖解碼從原發性腫瘤到繼發性腫瘤，典型模組到非典型模組的演變軌跡。此先進行基因注釋時，研究團隊已經注意到，內胚層發育模組似乎處在兩種基因表達路線的中間地帶。理論上而言，更原始的發育狀態應該與腫瘤生物學有密切關聯。研究人員從胎兒發育數據集出發，試圖系統表征內胚層狀態，并鑒別了 113 個在胎兒祖細胞中，與 ISC、成熟結腸細胞差異性表達的腸道胎兒特征。將此標記沿腫瘤進展軸繪制，發現其標志著典型與非典型基因表達狀態之間的明確中間態，即典型基因模組去分化為內胚層發育模組，再度進入非典型模組。

因此整體的遷移路線為，正常組織中的 ISC 異常生成原發性腫瘤，繼而去分化為 ISC 樣細胞、胎兒祖細胞，最后啟動轉移侵襲成為繼發性腫瘤。

圖6：所有腫瘤細胞中沿著擴散分量 DC1 的基因模組評分趨勢

（來源：參考資料 [1]）

在多個患者的腫瘤樣本內，研究人員觀測到包括 WNT 基因（TCF7、PTK 7）在內，一系列人類腸道胎兒祖細胞標記基因的普遍高度上調，由此推論這些基因可能是轉向非典型命運的調控者。除此以外，通過 Hotspot 偽排序分析，研究人員發現，在去分化喪失腸譜系身份的同時，與 WNT 相關的早期發育程序也有所上調。且在 Palantir 軌跡分析中，鱗狀樣和神經內分泌樣分支內 WNT 信號基因也均有上調。

圖7：單一患者的 Palantir 軌跡分析

（來源：參考資料 [1]）

WNT 蛋白是一類富含半胱氨酸殘基的分泌型糖蛋白，可通過自分泌和旁分泌方式介導信號傳導，從而調節細胞增殖、分化和凋亡等多個過程。在首例類器官培養中，WNT 即被作為關鍵信號通路因子加入培養基促進類器官生長。而在 CRC 中，異常的 WNT 信號傳導可能促進異常的 ISC 增殖并啟動腫瘤發生。而 LGR5 編碼 G 蛋白偶聯受體樣糖蛋白激素受體，可結合配體 R-spondin (RSPO) 1-4 蛋白，放大典型的 WNT/β-catenin 信號傳導，并催化 ISC 自我更新，因此已經成為一種潛在的腫瘤靶標。

WNT 在類器官和腫瘤生長中的重要作用肯定了類器官模型用于腫瘤研究的貼合度與巨大潛力。

為了確認非典型模組路線的起始是腫瘤細胞的自主變化，亦或是受結腸與轉移微環境間的差異驅動，研究團隊引入兩個類器官模型，分別是 KG146 原發性腫瘤類器官（OKG146P）和肝臟轉移瘤類器官（OKG146Li）。前者被視作為典型表達模組，后者涵蓋有從典型到非典型的完整譜系。

當使用 ISC 培養基培養類器官并添加 ISC 相關生態位維持因子時，OKG146P 保留了很大程度的 ISC 樣腫瘤細胞。而 OKG146Li 在 ISC 樣細胞之外，還保留有內胚層祖細胞，非典型基因表達很少，這與直接分離的轉移瘤組織特征不相符。

研究人員考慮到原發性腫瘤的高 ISC 水平以及低非典型模組表達這一雙面性，認為 ISC 培養基與生態位維持因子可能助長了 OKG146Li 中 ISC 水平的保留，并同步抑制了非典型基因表達。

研究人員隨后在 ISC 培養基上去除了 ISC 生態位維持因子，并嘗試將類器官更換到無腸道生長因子的培養基中，結果發現，OKG146Li 中的 ISC 標志物 LGR5 表達均有降低，非典型模組標志物表達上調。這種變化確認了 ISC 相關生長因子具有抑制非典型基因表達的能力，也反映出轉移瘤具有響應不同環境信號的強大可塑性。

圖8：轉移瘤類器官中的基因表達水平

（來源：參考資料 [1]）

為了確認轉移瘤類器官模型適應結腸和肝臟不同微環境的可塑性是否在體內保留，將其經異種移植到具有高度免疫缺陷的 NGS 小鼠模型內。

實驗發現，原發和繼發腫瘤在腫瘤發生的原位（即盲腸）中的生長模式相近；在轉移后的地區（肝臟）內，只有繼發性腫瘤生長。多重免疫熒光分析也發現，OKG146Li 衍生的異種移植物保留分化成所有典型和非典型狀態的能力，與患者體內的肝轉移類似。

圖9：小鼠肝內注射類器官后

（來源：參考資料 [1]）

研究人員假設，在中間態的胎兒祖細胞中，存在一種轉錄因子擁有抑制其向非典型命運轉化的能力。經過篩選，發現多效性 homeobox 轉錄因子 PROX1 擁有和非典型模組同步上調的最強同步性，并與典型模組的下調呈負相關趨勢。

圖10：PROX1 在腫瘤轉移抑制中的作用機理

（來源：參考資料 [1]）

在正常生理環境下，當腸道上皮細胞受損時，高度保守的轉錄調節因子 PROX1 會在再生細胞中表達，并參與再分化成為典型腸道狀態的修復過程。

使用基因工程敲低 PROX1 表達后，原發性腫瘤 OKG146P 類器官突破相關限制，非典型基因大量表達；向非典型狀態演進的繼發性腫瘤 OKG146Li 類器官 則受該誘導影響較小。但是，PROX1 敲低并不足以引起移植 OKG146P 的小鼠發生肝臟轉移，暗示存在有其他表型驅動因子尚未鑒別。

考慮到類器官的形成與 ISC 狀態類似，都需要從干性細胞重分化為多細胞類型，研究人員假定，當 PROX1 敲低后，從 RNA-seq 得到的單細胞會傾向于非典型基因表達而更難以進入 ISC 狀態，并因此形成更少的類器官。實驗結果表明，PROX1 與 ISC 的依賴關系取決于細胞狀態背景：具有典型細胞狀態的細胞系（OKG136P、OKG136Li、OKG173Li和OKG146P）在 PROX1 敲低后形成更少的類器官，而非典型細胞系（OKG146Li、OKG182CW2和OKG183Li2）則不受 PROX1 敲低的影響。

這也意味著 PROX1 對非典型基因表達和腫瘤轉移的限制性具有背景特性依賴，在轉移瘤或接受化療之后，更多的譜系不再受 PROX1 的限制，具有高度可塑性。

圖11：靶向 PROX1的類器官與對照組類器官生長情況對比

（來源：參考資料 [1]）

在現代醫學中，轉移性癌癥的治療一直是一個重大挑戰。本研究通過分析來自正常結腸、原發性和轉移性結直腸癌的三重標本，揭示了腫瘤轉移的演進路徑。

圖12：轉移瘤發展過程中細胞狀態的轉變

（來源：參考資料 [1]）

研究發現，正常的分化細胞首先會去分化成 LGR⁺ ISC 樣狀態，而后腫瘤侵襲前沿的細胞經歷發育逆轉成胎兒祖細胞樣狀態，從而進一步重編程為鱗狀細胞樣、神經內分泌樣等非典型狀態以適應不同的環境壓力。該非典型表達模組在轉移性生長期間富集，并可被 ISC 相關生物環境維持因子所抑制，往往指向不良預后結果，可作為臨床生物標志物使用。

此外，依托類器官模型，研究人員提煉出可能的非典型模組抑制分子 PROX1，不過 PROX1 也可能因此增強 ISC 樣狀態并在早期腫瘤發生中促進原發性腫瘤的生長。PROX1 參與上皮損傷修復步驟，而現階段的化療可能引起上皮損傷并促進腫瘤轉移。本文提出的新思路，有望對繼發性腫瘤根治提供另一種可能。

作者提到，與 PROX1 拮抗并驅動 CRC 轉移的其他因子還有待于闡明，且來自于轉移性腫瘤的類器官受限于穿刺獲得樣本的難度較高，培養成功率低等阻礙，依舊存在有一定桎梏，需要進一步的研究與優化。