此前的研究中，團隊以小鼠原代肝細胞衍生的HepOrg為起點，通過在培養基中補充Wnt3A或Wnt替代物，將類器官的形成效率提升了2-3倍，并實現了體外長期維持。不過，優化后的HepOrg中仍然存在部分未嵌入肝細胞或與肝細胞形成生理連接的膽管細胞類器官，因此研究人員進一步更替了培養基，使用此前共培養膽管與門管間充質細胞的培養基（MM），發現獲得的類器官中不僅肝細胞功能更為成熟、且門管周圍基因表達水平也有所提升。該MM培養基同樣也添加了Wnt3A作為支持。

接下來的目標是完全重建肝小葉門管區。研究人員利用搖動平臺，將優化后的HepOrg與膽管類器官、門周間充質細胞按精確比例混合。這一過程的成功率高達90%，獲得的多細胞結構即為“組合體”。該模型在中觀尺度上精準復現了天然組織布局：具有開放管腔的膽管被門管間充質細胞包圍，并嵌入在肝細胞實質中。

圖：組裝體復刻了小鼠原代組織的結構與基因表達

接下來，研究團隊試圖將培養方案移植到人源類器官中。同樣遵循循序漸進的思路，先培養可長期擴增的人類肝細胞類器官（h-HepOrgs），而后再嘗試與膽管類器官、門管區間質細胞進行三位一體的組裝。

長期以來，原代人類肝細胞在體外培養中極易失去表型并迅速死亡，這嚴重限制了其在疾病建模中的應用。本研究首先通過兩步膠原酶灌注法從患者肝組織中獲取細胞。在篩選培養基的過程中，研究人員通過分析肝癌類器官和部分肝切除后再生組織的轉錄組數據，識別出WNT和YAP信號通路是促進肝細胞退出靜止期并進入增殖狀態的關鍵。因此，類似于小鼠HepOrgs培養方案，Wnt3A 或 Wnt 替代物同樣是h-HepOrgs培養基中的“標配”。

通過在基礎培養基中添加WNT替代物（WntS）和LATS1/2抑制劑（TRULI），研究團隊成功誘導了肝細胞類器官的形成。更具突破性的是，研究人員發現移除培養基中的煙酰胺能使類器官的形成效率顯著提升近10倍。此外，與小鼠培養方案不同的是，由于人類肝細胞在體外極易去分化，為了維持其表型，人類方案通常需要更復雜的營養組合，包括特定的人類重組生長因子（如 HGF、hEGF、FGF10、FGF7）以及針對性的小分子抑制劑（如 TGF-β 抑制劑A83-01)），以防止細胞在培養過程中發生纖維化或轉化為無功能的成纖維細胞。

由于人類的膽汁代謝路徑更復雜。為了確保人類組合體能夠實現“膽汁引流”，當類器官擴增到一定階段后，再降低 Wnt 信號強度，并加入地塞米松，以促進肝細胞的代謝成熟，并增強了細胞間緊密連接的形成，還有助于形成微細的膽小管網絡，以期未來整合膽管類器官后轉運和代謝膽汁酸。

最終，在優化的EM2培養基中，團隊成功從28位年齡跨度為11至85歲的患者（包括5份凍存肝細胞樣本）中100%成功建立了h-HepOrgs。這些類器官表現出極強的擴增能力，能夠以1:2的比例每周傳代，持續擴增超過3個月（10代以上），且在長期培養過程中始終保持穩定的染色體數目。

h-HepOrgs可長期擴增

h-HepOrgs不僅在數量上實現了突破，在結構和功能上也表現出對體內肝組織的深度復刻。轉錄組分析顯示，擴增態的h-HepOrgs具有顯著的增殖特征，其基因表達譜與肝切除后的再生組織高度相似。當類器官轉入分化培養基（DM）后，其增殖標志物Ki-67的表達迅速下降，而功能性肝細胞標志物顯著上調。

在微觀結構上，h-HepOrgs能夠形成類似于體內組織的細長三維膽管結構，這些膽小管表面表達CD13、ZO-1和radixin等極性標志物。功能測試進一步證實，分化后的h-HepOrgs在白蛋白分泌能力和細胞色素P450活性（如CYP2C9）方面，與體外培養7天的原代肝細胞相當。值得注意的是，在維拉帕米代謝實驗中，h-HepOrgs產生主要代謝產物去甲維拉帕米的能力甚至超過了培養1天的原代肝細胞，這反映了其內部復雜的CYP酶系（如CYP2C8、CYP3A4/5）的高度協調性。

此外，該平臺還捕捉到了不同患者間的代謝差異，展示了其在個性化藥物代謝研究中的巨大潛力。

h-HepOrgs 保持體內功能和患者特異性特征

為了評估這些體外擴增細胞的生物學效能，研究團隊將其移植到了I型酪氨酸血癥（Fah^-/-Rag2^-/-Il2rg^-/-）小鼠模型中。實驗結果顯示，移植后的h-HepOrgs細胞能夠成功植入小鼠肝實質，并維持正常的肝細胞功能。

在關鍵的生存率測試中，注射了50萬個h-HepOrgs細胞（無論是擴增態還是分化態）或原代肝細胞的小鼠，在撤除NTBC藥物后，其生存曲線顯著優于對照組。這些移植細胞成功挽救了小鼠的致命性表型，證明了通過該技術擴增的肝細胞在組織工程和細胞治療領域具有極高的臨床轉化價值。

由于膽管類器官的生長極度依賴于 Wnt 和 Notch 信號通路的協同作用，研究團隊還添加了R-spondin 1、FGF10、EGF、HGF、煙酰胺、TGF-β 抑制劑（A83-01）以及福司可林以誘導管腔擴張，并增強膽管細胞的分泌功能。

此外，為了使組裝體盡可能接近體內真實比例，團隊通過量化發現肝組織中膽管細胞、門管區成纖維細胞和肝細胞的比例約為 15% : 8% : 77%?；诖?，他們將1個肝細胞類器官與約100個膽管細胞和25個成纖維細胞混合。

在AggreWell平板中培養24小時后，三種細胞自發組裝成緊湊的復合結構，并在培養6至16天后形成了穩定的門管區樣排布：膽管細胞構成的管腔處于中心或特定的功能單元內，其基底側被門管區成纖維細胞（PFs）精密包裹，形成一層薄薄的間質支撐層。最后，這一膽管-間質復合體被厚實的人原代肝細胞實質所包圍。這種由內向外的“膽管-間質-肝實質”層級結構，完美復現了天然肝小葉門管區的典型解剖布局。

人類門周組裝體重現了體內肝臟門周組織

在生理功能上，通過熒光示蹤證實肝細胞內的微觀膽小管網絡已與膽管類器官的大型管腔成功“對接”，實現了從肝細胞到膽管的完整膽汁引流通路；

分子水平的單細胞測序進一步顯示，組裝體中的肝細胞特異性增強了如 CYP2F2 等門管周圍區標志基因的表達，展現出明確的空間區室化特征；

同時，研究團隊還驗證了成纖維細胞與膽管細胞間通過 Jagged1-Notch 等信號通路進行的復雜細胞互作，這種對話維持了組織的結構穩態；

最后，在代謝表現上，組裝體的尿素生成、糖異生和白蛋白分泌能力（均為門靜脈功能）顯著優于單一類器官模型，并能高度仿真膽管擴張等纖維化病理反饋，從而在解剖、分子、生理及病理四個層面完成了對門管區微環境的系統性還原。

這一高度仿生的組裝體平臺為研究復雜的肝臟疾病提供了理想工具。研究團隊通過將成纖維細胞的比例增加20倍（即1個肝細胞類器官對應500個成纖維細胞），構建了“纖維化樣”組裝體。在這種病理模型中，研究人員觀察到了典型的纖維化特征，包括TGFβ信號通路的顯著激活，這與原發性硬化性膽管炎（PSC）和原發性膽汁性肝硬化（PBC）患者的轉錄組特征高度吻合。

形態學上，纖維化組裝體出現了明顯的囊性病變，類似于患者組織中的導管反應。更深入的免疫熒光分析發現，在纖維化環境下，部分肝細胞（HNF4A⁺）開始表達膽管細胞標志物KRT19，并形成了管腔結構，這揭示了在過度間質擠壓下肝細胞向導管細胞轉分化的潛在病理過程。此外，模型還成功模擬了纖維化過程中常見的TNF、IL-4和IL-6信號富集以及肝細胞凋亡增加等特征。

組裝體模擬人類膽道纖維化的某些方面

Meritxell Huch團隊的這一研究成果標志著肝臟體外建模從“單細胞類型類器官”邁向了“多細胞復雜組裝體”的新階段。通過建立包含28位捐贈者的活體類器官庫，研究者可以更深入地探索個體差異對肝臟再生、代謝和疾病進展的影響。

這種能夠精準復刻人類門管區組織架構的組裝體系統，不僅為解開膽管纖維化等慢性肝病的分子機制提供了新平臺，也為藥物篩選和毒性測試提供了比動物模型更具人體相關性的選擇。隨著技術的不斷成熟，這一平臺有望在加速創新藥物研發、實現早期精準診斷以及推動個性化醫療領域發揮核心作用，為全球數以百萬計的慢性肝病患者帶來新的希望。