科學問題：本文通過單細胞RNA測序分析，研究膝關節纖維化的細胞異質性和細胞間相互作用機制，揭示CCN2在成纖維細胞與巨噬細胞相互作用中的作用及其通過TGF-β通路介導的纖維化過程，為膝關節纖維化提供潛在的生物標志物和治療靶點。

實驗材料：3名膝關節纖維化組(AF組) 和3名無纖維化組(NC組)

膝關節纖維化（Knee Arthrofibrosis）是一種以關節活動受限為特征的疾病，常在膝關節手術或損傷后發生，給患者帶來極大的痛苦和沉重的經濟負擔。盡管目前已有多種治療方法，但治療效果仍不盡如人意，其發病機制也尚未完全明確。近期，一項基于單細胞RNA測序分析的研究揭示了CCN2在膝關節纖維化中的關鍵作用，為這一疾病的診斷和治療提供了新的方向。研究人員通過對膝關節纖維化患者和對照組患者的滑膜組織進行單細胞轉錄組學分析，發現纖維化組中巨噬細胞和成纖維細胞數量顯著增加，而類風濕性滑膜細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞和T細胞數量減少。進一步研究發現，成纖維細胞與巨噬細胞之間存在相互作用，并通過TGF-β通路誘導成纖維細胞中CCN2的表達，進而導致纖維化。CCN2不僅在成纖維細胞的促纖維化功能（激活、增殖和遷移）中發揮關鍵作用，還與膠原蛋白體積、TGF-β表達水平呈正相關，與患者的臨床預后指標呈負相關。這一發現表明CCN2可能是膝關節纖維化潛在的生物標志物，為未來的診斷和治療提供了新的靶點。

單細胞轉錄組測序、伯優^®單細胞測序組織保存液

（服務產品由伯豪生物提供）

1.通過流式細胞術和單細胞RNA測序分析構建的人類滑膜組織的單細胞圖譜

為了闡明膝關節纖維化（AF）的潛在機制，我們對膝關節纖維化患者（AF組）和陰性對照組（NC組）的滑膜組織進行了流式細胞術（FCM）和單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析（圖1a），共六名患者。經過質量控制后，我們共獲得68,144個細胞，這些細胞可以被聚類為六個不同的細胞群，分別被注釋為：成纖維細胞（THY1、LUM）、巨噬細胞（CD14、MS4A4A）、類風濕性滑膜細胞（FLS）、內皮細胞、血管平滑肌細胞（VSMC）和T細胞（圖1d、e），所有這些細胞類型在六名患者中均有發現（圖1f）。我們觀察到AF樣本中巨噬細胞和成纖維細胞的數量較NC樣本顯著增加（P<0.001）（圖1g），這與流式細胞術的結果一致。成纖維細胞、巨噬細胞、FLS、內皮細胞和VSMC的細胞亞群進一步展示在圖1h中?？傮w而言，流式細胞術（FCM）和單細胞轉錄組分析均表明，膝關節纖維化（AF）與巨噬細胞和成纖維細胞的富集之間存在密切關聯。

2.人類滑膜成纖維細胞的不同纖維化特征

位于膝關節滑膜下層的成纖維細胞在AF中起關鍵作用。正常情況下，這些細胞通過產生細胞外基質（ECM）維持組織結構和穩態，但在纖維化疾病中，它們過度產生ECM并誘導細胞因子分泌，從而促進纖維化。通過單細胞轉錄組分析，作者鑒定出三種成纖維細胞亞群：DPP4⁺成纖維細胞（Fib1）、TNC⁺成纖維細胞（Fib2）和APOD⁺成纖維細胞（Fib3）（圖2a、b）。與對照組（NC）相比，AF組中Fib1的比例顯著增加，而Fib3的比例則有所下降（P<0.01）（圖2c）。這表明Fib1可能在AF的發生中發揮重要作用。作者發現，Fib1和Fib2亞群因高表達膠原蛋白COL1A1和COL1A2，被認為是促纖維化的肌成纖維細胞，而Fib3亞群則表現為靜止狀態，與纖維化關系不大。GO分析顯示，促纖維化通路在Fib1和Fib2中顯著富集，而Fib3則富集于抗纖維化通路。此外，Fib1以DPP4高表達為特征，Fib2高表達TNC和CDH11，這些基因均與纖維化密切相關；Fib3則以APOD、C3和CXCL14高表達為特征，與纖維化相關性較低。這些發現為理解膝關節纖維化的細胞機制提供了重要依據。為了研究這三種亞群之間的分化路徑，作者進行了RNA速率分析。結果顯示，成纖維細胞的分化主要由Fib1驅動，存在從Fib1到Fib2和從Fib1到Fib3的兩條分化路徑（圖2g）。這與DPP4⁺成纖維細胞作為祖細胞的先前研究結果一致。

3. 滑膜巨噬細胞及其他滑膜細胞的鑒定與分子特征分析

巨噬細胞是促纖維化因子（如TGF-β、IL-1β和PDGF）的重要來源，在膝關節纖維化（AF）中具有重要作用，并表現出高度的可塑性和異質性。單細胞轉錄組分析鑒定出三種巨噬細胞亞群：Macro1（TREM2⁺）、Macro2（TTN⁺）和Macro3（EGFR⁺）（圖3a、b）。與對照組（NC）相比，AF組中Macro1的比例顯著增加（P<0.001），而Macro2的比例顯著減少（P<0.001），Macro3的比例在兩組中無顯著差異（P=0.247）（圖3c）。

研究發現，Macro1和Macro2高表達M1型標記物，參與固有免疫反應，如補體激活和白細胞激活（圖3f）；而Macro3高表達M2型標記物和促纖維化基因（如EGFR和PDGFRα），與細胞通訊密切相關（圖3f）。這表明Macro3可能通過與成纖維細胞的相互作用，在纖維化過程中發揮重要作用。通過RNA速率分析，作者發現巨噬細胞亞群Macro1傾向于分化為Macro2，而Macro3相對穩定，形成一個與Macro1和Macro2不同的獨特細胞簇（圖3g）。Macro3可能參與纖維化過程。這表明滑膜組織中的巨噬細胞具有高度異質性，且Macro3可能在纖維化中發揮作用。

4.基于成纖維細胞與巨噬細胞相互作用的CCN2鑒定為膝關節纖維化（AF）的潛在生物標志物

作者通過CellChat分析細胞間相互作用，發現AF和NC組中內皮細胞、血管平滑肌細胞以及免疫細胞與非免疫細胞之間存在較高相互作用概率。與NC組相比，AF組中成纖維細胞與巨噬細胞的相互作用顯著增強（圖4a）。結合成纖維細胞和巨噬細胞在滑膜組織中比例增加以及纖維化相關性，研究聚焦于成纖維細胞與巨噬細胞的相互作用（圖4b）。分析發現，成纖維細胞與巨噬細胞的相互作用在多種促纖維化通路（如非典型Wnt、TGF-β、tenascin、FGF和CXCL通路）中上調，且成纖維細胞和巨噬細胞在這些通路中分別扮演接收者和發送者的角色，這些途徑都是促纖維化的（圖 4c ）。這一結果與 Fib1 和 Fib2 主要參與纖維化過程，而 Macro3 更多地參與細胞間通訊的觀察結果一致。

為了進一步研究分子機制和潛在的生物標志物，作者專注于成纖維細胞中與通路相關的基因變化，鑒定了21個相關基因（圖4d），并基于統計差異進一步篩選出19個潛在的生物標志物基因（PBGs）。GO分析顯示PBGs在促纖維化通路中高度富集（圖4e）。通過分析成纖維細胞中AF組與NC組間前50個差異表達基因（DEGs）的蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡，研究人員發現CCN2基因同時是PBGs和中心樞紐蛋白之一（圖4f）。進一步比較兩組細胞中PBGs的表達水平，發現CCN2在AF組中的表達顯著高于NC組，且位于成纖維細胞DEGs的前五位。因此，CCN2被認為是AF的潛在生物標志物。

在深入探索AF的分子機制和尋找潛在生物標志物的過程中，作者的研究團隊通過單細胞轉錄組圖譜揭示了成纖維細胞與巨噬細胞之間的相互作用，以及TGF-β通路中CCN2在AF中的關鍵作用。這些發現不僅增進了我們對AF病理過程的理解，而且為CCN2作為新型生物標志物的可能性提供了有力證據。

參考文獻：

Li Z, Jiang J, Cai K, Qiao Y, Zhang X, Wang L, Kang Y, Wu X, Zhao B, Wang X, Zhang T, Lin Z, Wu J, Lu S, Gao H, Jin H, Xu C, Huangfu X, James Z, Chen Q, Zheng X, Liu NN, Zhao J. CCN2 mediates fibroblast-macrophage interaction in knee arthrofibrosis based on single-cell RNA-seq analysis. Bone Res. 2025 Feb 24;13(1):26. doi: 10.1038/s41413-025-00400-9. PMID: 39994205; PMCID: PMC11850813.