文章標題：N6-methyladenosine (m6A) in 18S rRNA?promotes fatty acid metabolism and oncogenic?transformation

發表期刊：Nature Metabolism

影響因子：19.865

作者單位：中山大學第一附屬醫院

百趣生物提供服務：非靶標代謝流分析

研究背景

能夠快速無限地生長和分裂是癌細胞最廣為人知的特征之一，癌細胞核糖體生物合成失調以及mRNA翻譯活性異常，均會促進癌癥的進展，然而，癌癥中核糖體生物生成失調的分子機制仍不清楚。

核糖體生物發生是一個高度協調的過程，最近的研究表明，不同的RNA轉錄后修飾在基因表達和癌癥進展的調節中均發揮重要作用。rRNA占細胞總RNA的80%以上，并受到不同的修飾，但是對于rRNA修飾在調節癌癥中的rRNA加工和功能中的功能和機制知之甚少。關于mRNA中m6A的修飾已經成為癌癥進程的關鍵信號，而rRNA中m6A修飾的研究還有很多待揭示的問題。

為揭示METTL5介導的18S rRNA m6A修飾對決定細胞命運和生長的作用，讓我們走入作者的研究故事。

研究結果

1.METTL5和TRMT112在各種癌癥中上調，并與不良預后相關

根據前人的報道在rRNA中存在兩個酶METTL5和TRMT112分別催化18SrRNA上1832位（m6A1832)和28SrRNA上4220位（m6A4220)的甲基化修飾。為了探明m6A修飾在癌癥進程中的作用，作者首先對TCGA數據進行了分析，發現包括HCC在大多數TCGA癌癥類型中METTL5和TRMT112均顯著上調（圖1a-c），并且發現METTL5和TRMT112的高表達與肝癌患者的晚期病理分級、腫瘤分期、總體生存率均相關（圖1e-h）。為了進一步確定上述現象，作者在HCC細胞系以及HCC組織樣本中做了進一步確認，正如預期的那樣，無論在細胞系還是組織樣本中，相較于對照組，METTL5和TRMT112的mRNA和蛋白水平均有不同程度的上調（圖1i-m）。同時m6A定量檢測也確認了，在HCC細胞系和HCC患者樣本中m6A1832的修飾顯著增高（圖1n）。顯然METTL5和TRMT112介導的18S rRNA m6A修飾很可能在HCC的進程中有重要的作用。

圖1. MettL5在各種癌癥中上調，并與低生存率相關

2.METTL5的過表達在體外和體內促進肝癌進展

為了深入研究METTL5的致癌功能，作者首先構建了METTL5過表達肝癌細胞系（圖2a，b），顯然METTL5的過表達顯著的增加了HCC細胞中18S rRNA的m6A修飾（圖2c)。不出意外的，METTL5的過表達從生長、遷移、侵襲等各方面促進了細胞系的活力（圖2d-k)。表明METTL5可以在體外促進HCC的進展。

回到體內實驗，METTL5的mRNA和蛋白質在METTL5過表達質粒轉染的小鼠模型中均顯著上調（圖2l-n）。腫瘤形態檢測與免疫組織化學實驗同樣從表型角度表明METTL5過表達的小鼠腫瘤有更高的增殖活性，綜上所述，METTL5在體內體外均會促進HCC腫瘤的發生。

圖2. MettL5的過表達在體外和體內促進肝癌的發生

3.METTL5介導的18S rRNA m6A修飾調節80S核糖體組裝和全局mRNA翻譯

為了全面分析METTL5在HCC中的功能，作者同樣的對HCC細胞中的METTL5進行了敲低處理（圖3a）。在體外試驗中，METTL5敲低的處理使得HCC細胞的生長能力和集落形成能力均有所降低（圖3b-d），除了增殖表型之外，METTL5的缺失對HCC的凋亡以及細胞周期均產生了不良的影響（圖3e-l），結合上文的過表達數據，表明METTL5確實對HCC細胞起到了促進的作用。

作者進一步探究METTL5的作用機制，發現在METTL5缺失的細胞中，18S rRNA的m6A修飾顯著減少（圖3m)，同時為了確定METTL5對18S rRNA的m6A的影響并非是通過影響18S rRNA表達量導致的，作者對18S rRNA表達量進行了檢測（3圖o）。18S rRNA是核糖體的主要成分，作者進一步研究METTL5對核糖體功能的影響機制，多聚體分析表明METTL5的敲減會使80S核糖體組裝受損（圖3q）。

圖3. MettL5基因敲除體外抑制肝癌的發生

4.METTL5調節肝癌細胞的脂肪酸代謝

通過核糖體測序分析發現。受METTL5缺失影響的mRNA主要富集于非酒精性脂肪肝、脂肪酸生物合成等途徑，表明METTL5對HCC進展的影響很可能與脂肪酸代謝重組相關（圖4a-c）。脂質組學分析表明受METTL5敲除影響顯著降低的脂質包括游離脂肪酸、甘油三酯、膽固醇（圖4d-f)。為了確認這些受影響的脂質的來源信息，作者做了[U-13C]葡萄糖的代謝流分析，發現許多長鏈脂肪酸及其下游產物均被U-13C標記，表明這些脂肪酸來源于葡萄糖的生物合成，而隨著METTL5的敲除，這些碳代謝產物的U-13C標記率顯著降低了，顯然METTL5影響了肝癌細胞中脂質代謝的重編程（圖4h）。

作者進一步對長鏈脂肪酸進行LC-MS分析表明，大多數長鏈脂肪酸特別是多不飽和脂肪酸隨著METTL5敲除顯著降低，對代謝物進行富集分析發現，這些顯著減少的多不飽和脂肪酸主要與β氧化途徑相關（圖4i-k），說明METTL5的缺失可能會損害細胞的β氧化。

圖4. MettL5敲除損害脂肪酸β-氧化

5.ACSL4介導MettL5在脂肪酸代謝和肝癌進展中的功能

為了深入探究MettL5潛在的分子機制，作者分析了靶mRNA的特征，在富含脂肪酸代謝途徑的mRNA中，酰基輔酶A合成酶長鏈家族（ACSL）成員，包括ACSL1、ACSL3、ACSL4和ACSL5，在缺乏METTL5的細胞中顯示翻譯效率降低，同樣的METTL5缺乏的細胞中ACSL家族蛋白的表達水平也同步降低了（圖5f）。

ACSL家族能夠將長鏈脂肪酸轉化脂肪?；o酶a酯，在癌癥的長鏈脂肪代謝中起到至關重要的作用，為了分析ACSL在METTL5對HCC調控中的作用，作者在METTL5敲除的細胞中過表達的了ACSL4進行拯救實驗。通過強制過表達ACSL4增加了細胞中的脂質水平（圖5g-j）。同時細胞的增殖、集落形成、侵襲等能力均受ACSL4 表達而得到增強，（圖5k-q)，ACSL4 的強制表達同樣的減少了HCC細胞的凋亡，并促進了細胞周期的進展（圖5r-u)。上述實驗說明，ACSL4的過表達可以在一定程度上挽救因MettL5缺失而受到的影響的癌癥進展。為了研究結論的完整性，作者通過在MettL5過表達體系中敲除ACSL4，以及添加β氧化阻斷劑的方式，證實了MettL5在肝癌中的致癌作用需要依賴ACSL4對脂肪酸β-氧化的調節作用。最后作者在小鼠體內同樣的驗證了上述現象。

圖5. ACSL4介導MettL5在脂肪酸代謝和肝癌進展中的功能

研究小結

總的來說，本研究提供了強有力的體外和體內證據，支持METTL5介導的18S rRNA m6A修飾在肝癌中的致癌作用。此外，作者還進一步證明了rRNA表觀遺傳修飾、mRNA翻譯和脂肪酸代謝之間的交聯，為在轉化水平上開發肝癌治療的靶向治療提供了有力的證據。

科研延伸

BIOTREE非靶代謝流解決方案：無偏向性的檢測所有帶同位素標記的代謝物，廣泛篩選同位素標記的代謝物參與的代謝途徑或基因敲除前、后代謝速率變化。

文/阿趣代謝組學