J Ethnopharmacol.|甘肅中醫藥大學張志紅老師研究團隊破解經典藥對奧秘，精準闡釋當歸-白芍藥對抗肝纖維化物質基礎與作用機制
英文標題：Integrated network pharmacology, transcriptomics and metabolomics to explore the material basis and mechanism of Danggui-Baishao herb pair for treating hepatic fibrosis
發表期刊：Journal of Ethnopharmacology
影響因子：5.4
客戶單位：甘肅中醫藥大學
合作產品：DIA-中藥入血組、新一代代謝組學NGM 2 Pro
研究背景
肝纖維化（Hepatic fibrosis，HF）是多種慢性肝損傷引發的共同病理修復反應，若持續進展可導致肝硬化、肝細胞癌等終末期肝病。目前，針對HF的有效治療手段仍顯不足，因此探尋有效的抗纖維化藥物至關重要。當歸逍遙散作為經典中藥復方，臨床研究證實其對肝硬化患者肝損傷具有改善作用。在該復方中，當歸-白芍藥對（Danggui-Baishao herb pair，DB）是發揮核心作用的關鍵。與現代復雜中藥復方相比，精簡的草藥配對因其化學成分相對明確、作用機制更易于闡釋而受到越來越多的學術關注。當歸-白芍藥對是治療肝纖維化的關鍵，然而，關于兩藥聯合應用抗肝纖維化的專項研究尚不充分。本研究采用轉錄組學、代謝組學和網絡藥理學相結合的方法，旨在闡明DB的物質基礎和作用靶點，同時研究其對心衰的潛在作用和機制。
研究概述
圖1 研究流程圖
研究成果
1、實驗藥理學
1.1.DB拮抗CCl?所致肝損傷
肝臟功能及炎癥相關指標的檢測結果顯示（圖2），與對照組相比，CCl?模型組大鼠血清ALP、AST、ALT、Col-IV、PCIII、HA、LN及肝臟IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著升高；而經過秋水仙堿和不同劑量DB治療后，上述指標明顯下降。同時，實驗期間，對照組大鼠體重顯著增加，而模型組體重增長緩慢，經藥物干預后體重下降趨勢得到改善。
圖2 DB對肝功能及炎癥相關指標的影響
1.2.DB對心力衰竭大鼠肝臟病理的影響
為評估DB對CCl?誘導大鼠肝損傷的保護作用，采用HE和Masson染色觀察肝組織病理變化（圖3）。HE染色顯示，對照組肝小葉結構完整，肝細胞形態規則、排列整齊，肝竇無擴張，無炎癥改變；CCl?組則見肝小葉結構破壞，中央靜脈周圍纖維間隔增生，形成大小不一的假小葉，伴淋巴細胞浸潤及肝細胞彌漫性水樣變性。DB干預后上述病變明顯減輕，提示其可緩解CCl?所致肝損傷。Masson染色進一步顯示，模型組膠原纖維顯著增多，而秋水仙堿和DB給藥組膠原沉積明顯減少。綜合生化與組織學結果，證實DB能有效阻止CCl?誘導的肝功能異常及病理結構改變，發揮抗肝纖維化作用。
圖3 HE和Masson染色結果
1.3.DB對肝組織膠原蛋白的影響
肝星狀細胞活化是HF的關鍵環節。α-SMA是HSCs活化的標志物，而Col-I是HSCs激活后釋放的主要細胞外基質。通過免疫組化和Western blot技術檢測α-SMA與Col-I的表達水平，可在一定程度上反映肝纖維化的嚴重程度。在CCl4誘導的肝纖維化大鼠肝組織中，α-SMA與Col-I的表達均顯著升高，而經過DB干預后，這兩種蛋白的表達均被顯著抑制（圖4）。
圖4 DB對肝組織中膠原蛋白的影響
2、DB入血分析
給正常大鼠給藥后，在血漿中檢測到19種入血成分，通過它們的保留時間、加合離子形式及其碎片信息進行了鑒定（表1）?；衔锏目傠x子色譜（TIC）結果如圖5所示。
表1 大鼠入血成分
圖5 TIC總離子流圖
3、網絡藥理學分析
將DB活性成分對應的608個靶點與6711個HF相關靶點進行比對，發現453個交集靶點，并據此構建PPI網絡（圖6A）。拓撲分析顯示，連接度排名前十的關鍵靶點依次為AKT1、IL6、HSP90AA1、TNF、BCL2、IL1β、TLR4、PIK3R1、BCL2L1和MTOR，這些靶點可能介導DB抗HF作用。利用Cytoscape 3.2.1構建成分-靶點網絡（圖6B）。對354個潛在核心靶點進行GO富集分析發現，生物學過程主要涉及激素反應、磷酸化代謝正調控和外源刺激反應（圖6C）。KEGG信號通路分析顯示，PI3K-Akt、MAPK和VEGF等信號通路位列前20條關鍵通路（圖6D）。
圖6 網絡藥理學分析
4、DB對肝纖維化大鼠肝臟轉錄組學的影響分析
研究進一步利用轉錄組測序探討DB改善HF的分子機制。PCA得分圖（圖7A）顯示，造模6周后CCl?誘導HF大鼠的肝轉錄組譜與對照組有顯著分離；而經DB治療的肝纖維化模型大鼠轉錄組樣本獨立聚為一類，與模型組明顯分離，且位于對照組與模型組之間并更接近對照組樣本。這表明為期四周的DB水提物治療能影響肝纖維化模型大鼠的肝臟基因表達。通過設定篩選條件，共鑒定出以下差異表達基因（DEGs）：對照組與模型組比較存在1347個DEGs，其中1039個基因表達上調，308個基因表達下調（圖7B）；模型組與DB治療組比較存在404個DEGs，其中181個基因表達上調，223個基因表達下調（圖7C）。維恩圖顯示各組間存在97個共同DEGs，其中91個基因在組間呈現差異表達，這些可能是DB治療肝纖維化的關鍵DEGs（圖7D）。進一步對上述DEGs進行GO富集分析（圖7E）和KEGG通路富集分析（圖7F）發現：GO富集分析表明DB能廣泛影響碳水化合物代謝、晝夜節律調節、胰島素反應、炎癥反應及脂質生物合成等生物學過程，這些多元生物過程共同促進對肝纖維化大鼠的治療作用；KEGG通路分析則顯示DB治療主要影響甘油磷脂代謝、鞘脂信號傳導、鐵死亡等相關通路。這些發現提示，DB通過改變基因表達并映射至相關信號通路，從而有效調控肝纖維化大鼠的肝臟轉錄過程。
圖7 DB對肝纖維化大鼠肝臟轉錄組學的影響分析
5、DB對肝纖維化大鼠肝臟代謝組學的影響分析
肝臟樣本的主成分分析（PCA）模型結果顯示對照組、模型組和DB組之間存在明確的組間關聯，并觀察到顯著的組別代謝物聚類趨勢（圖8A）。采用正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）方法檢測對照組與模型組、模型組與DB組之間的整體代謝差異，以識別潛在差異代謝物，兩組間呈現明顯的聚類分離（圖8C-D）。以VIP>1.0且P<0.05為差異代謝物的篩選標準，最終確定94種差異代謝物作為潛在生物標志物，與模型組相比，DB組中59種代謝物表達上調，35種表達下調（圖8I）。將差異代謝物導入MetaboAnalyst 5.0進行代謝通路分析，Impact≥0.1的潛在相關通路包括：煙酸和煙酰胺代謝、戊糖與葡萄糖醛酸轉化、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代謝以及核黃素代謝（圖8J）。
圖8 DB對肝纖維化大鼠肝臟代謝組學的影響分析
6、代謝組學、轉錄組學和網絡藥理學的綜合分析
為闡明DB影響肝纖維化的體內分子機制，研究整合了網絡藥理學、轉錄組學和代謝組學進行系統分析。首先，通過KEGG數據庫分別識別差異表達基因（DEGs）與差異代謝物所對應的通路，將兩組通路取交集后獲得31條共有通路，這些通路與19個DEGs及20種差異代謝物相關聯。繼而采用Pearson相關系數法對關鍵DEGs與差異代謝物進行關聯分析（圖9A）。篩選出11個核心基因（GCLC、RGMA、LBP、GOT1、PSPH、GBE1、PIK3R1、BCL2A1、CD63、GPAT3、LEPR）和8種核心代謝物作為潛在關鍵靶標。最后通過Metascape數據庫對上述11個核心靶標進行KEGG通路富集分析，以明確DB治療肝纖維化的核心作用通路。結果顯示（圖9B），NF-κB信號通路為主要富集通路，提示DB可能通過調控NF-κB信號通路影響炎癥水平，進而發揮抗肝纖維化作用。結合網絡藥理學分析結果及文獻調研，初步證實DB可能通過PI3K/Akt/NF-κB信號通路治療肝纖維化。
圖9 轉錄組和代謝組學的聯合分析
7、分子對接
選取五個核心靶點與18種入血成分進行分子對接，分子對接結合能熱圖如圖10A所示。結果顯示，山奈酚（C9）、苯甲酰芍藥苷（C13）、芍藥內酯苷（C12）、芍藥苷（C6）及藁本內酯A（C18）與五個核心靶點均具有良好的結合作用。結合網絡藥理學拓撲分析結果，判定C9、C13、C12、C6及C18為DB抗肝纖維化作用的物質基礎。
以苯甲酰芍藥苷與五個核心靶點的對接為例，其可視化結果如圖10B-F所示。圖中顯示，苯甲酰芍藥苷與NF-κB靶點的GLU:22和GLN:266形成氫鍵作用，與AKT1靶點的TRP:99和LYS:8產生氫鍵結合，與TLR4靶點的SER:251、LEU:252、ASN:279、LYS:279、TRP:275形成氫鍵網絡，與PIK3R1靶點的MET:194、MET:192建立氫鍵連接，并與IκBα靶點的ARG:129、ARG:56、TRP:66、GLU:64形成多重氫鍵作用，表明該化合物能與核心靶點形成穩定復合物。
圖10 分子對接
8、Western blotting表達驗證
通過檢測TLR4、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、IκBα、NF-κB p65及p-NF-κB p65蛋白的表達水平，揭示了DB抗CCl?誘導大鼠肝纖維化的潛在作用機制。結果顯示，與對照組相比，模型組中TLR4、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、IκBα、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白表達均顯著升高（圖11A）。對各條帶進行灰度定量分析，與模型組相比，DB治療組TLR4、p-PI3K、p-AKT、NF-κB p65和p-NF-κB p65的表達水平顯著降低，而IκBα的表達明顯回升（圖11B-F）。
圖11 DB對PI3K/Akt/NF-κB信號通路的影響
研究小結
本研究從DB提取物中鑒定出19種入血成分，并基于網絡藥理學、轉錄組學與代謝組學整合策略，系統探究DB治療肝纖維化的核心靶點與作用機制。綜合分析表明，DB可能通過山奈酚、苯甲酰芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、藁本內酯A等活性成分，作用于PI3K/Akt/NF-κB信號通路，改善肝纖維化大鼠的肝功能及纖維化程度。本研究為深入探索DB抗肝纖維化的作用機制提供了數據與理論基礎，為其臨床轉化應用創造了條件。