本期我們將系統解析CRISPR/Cas系統的編輯效率驗證技術，幫助大家完成基因編輯實驗的最后確認！
基因編輯效率，簡單來說，就是成功實現目標基因編輯的細胞或樣本占總細胞或樣本的比例。這個比例直接反映了基因編輯工具的有效性，無論是用于科研探索，還是朝著基因治療、生物制藥等實際應用邁進，精準驗證基因編輯效率都是必不可少的步驟。
T7核酸酶I
目前市面上最基礎的基因編輯檢測工具——T7核酸酶I（T7 Endonuclease I），它就像一位敏銳的“偵察兵”，作為核酸內切酶能夠特異性的識別并切割不完全配對的DNA序列(non-perfectly matched DNA)。常用于ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas9等導致的基因突變的鑒定。如果通過基因編輯技術成功獲得了插入或缺失的突變基因序列，那么當基因編輯后的DNA與野生型DNA放在一起時，將其變性再退火復性，野生型的DNA單鏈和基因編輯后的DNA 單鏈會錯配形成異源雙鏈DNA結構。此時，加上T7核酸內切酶I就可以特異性的識別錯配的異源雙鏈DNA并在錯配位點附近進行切割。通過瓊脂糖凝膠電泳即可顯示酶切后的條帶，確認基因編輯效率的有效性。
近岸蛋白的T7 Endonuclease I（Cat.No.:M017）能有效檢測ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas9等基因編輯之后形成的突變體，識別切割效率高，是基因編輯檢測的不二之選！
產品用途
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基因突變和SNP的檢測，可應用于TALEN、CRISPR/Cas9基因編輯形成的突變體檢測； -
識別錯配DNA，分解四方向交叉DNA或分支DNA； -
檢測或切割異源二聚體DNA和切割DNA； -
隨機切割線性DNA進行shot-gun克隆。
產品性能
01 突變體檢測效果好
圖例）T7EI法檢測突變體。泳道1：野生型條帶700bp； 泳道2：突變型條帶700bp； 泳道3：野生型條帶與突變型條帶退火，產生T7EI切割條帶300bp+400bp。
02 有效切割電轉后的突變體
圖例）將不同Cas9/sgRNA RNP復合物通過電轉方式遞送至293T細胞，48h后收集細胞，抽提基因組DNA。使用T7EI（Cat#M017）檢測，結果表明相同條件下，近岸蛋白的Cas9蛋白切割效率要優于其他同類品牌。同時證明T7EI有效檢測基因編輯效率。
操作步驟
1.取轉染后的細胞培養48~72h；
2.收集細胞，提取細胞的基因組（突變體DNA）；
3.使用高保真PCR（2×Fast Pfu Master Mix (Quick Load)，Cat.No.: E035）分別以突變體DNA和野生型DNA為模板，擴增靶基因編輯的區域；
注：突變位點避免位于片段中間，便于區分切割后的條帶
4.變性退火PCR產物
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反應體系
組分 投入量 10×T7 Endonuclease I Reaction Buffer 1μl PCR產物（野生型：突變型=1:1） 0.3μg RNase Free Water Up to 9.5μl -
反應條件
溫度 時間 95℃ 5min 95℃-85℃ -2℃/sec 85℃-25℃ -0.1℃/sec 16℃ 2min -
T7EI酶切反應
當PCR結束后，在PCR產物中加入0.5μl T7EI酶，37℃保溫15-30min，立即加入DNA loading buffer終止反應，混勻后65℃保溫10min，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。
基因編輯檢測相關產品推薦
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PCR一代測序法（Sanger法）
在基因編輯過程中會在靶基因引入插入或缺失，直接提取基因組DNA，擴增靶基因附近片段，通過PCR一代測序法鑒定，如果被編輯后的位點檢測到雙峰或者雜峰，則表示產生了有效的基因編輯。
NGS高通量深度測序法
近岸蛋白有適配NGS測序的多種通用型接頭可供選擇：
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NovoNGS® DNA Adapters Set1–Set2 for Illumina® |
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質譜分析法
質譜分析法的核心在于測定生物分子質荷比來分析其結構。在基因編輯檢測時，先將基因編輯后的細胞或組織樣本提取蛋白質，經純化、酶解處理成肽段混合物。通過電噴霧離子化（ESI）或基質輔助激光解吸離子化（MALDI）等方式，使肽段轉化為氣態離子。離子束進入質量分析器，在電場和磁場作用下，不同質荷比的離子發生分離，例如在飛行時間質量分析器中，離子依飛行時間差異確定質荷比。最后得到質譜圖，將其與數據庫中已知蛋白質質譜圖比對，分析肽段質荷比、相對豐度等信息，推斷蛋白質氨基酸序列。由于基因編輯會改變蛋白質編碼序列和一級結構，通過對比質譜圖變化，可間接反映基因編輯對蛋白質的影響，評估基因編輯效果 。
流式細胞術
流式細胞術是基于細胞光學特性與熒光標記的檢測技術。當基因編輯后的細胞樣本制成單細胞懸液后，在壓力驅動下，細胞依次通過流動室與激光束相交。細胞受激光激發產生熒光，同時會產生散射光，前向散射光與細胞大小相關，側向散射光與細胞內部結構復雜度有關 。如果基因編輯使細胞表達特定標記蛋白，標記特異性抗體與目標蛋白結合后，細胞攜帶熒光信號。光學系統收集這些熒光和散射光信號，熒光檢測器（光電倍增管）和散射光檢測器（光電二極管）將光信號轉化為電信號。通過對這些信號的分析，如繪制熒光強度與細胞數量的直方圖等，能夠計算出基因編輯成功表達目標蛋白的細胞比例，實現對細胞群體的多參數、定量分析 。
下一期，我們將聚焦基因編輯實驗操作過程中脫靶問題的解決方案，從優化編輯工具到調整實驗條件，手把手教你提高基因編輯實驗的成功率！記得持續關注，一起在基因編輯的道路上披荊斬棘！
近岸蛋白能提供基因編輯系列產品的全套解決方案，各位小伙伴可以聯系官方后臺申請試用~
CRISPR/Cas系統相關產品推薦表
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