Food Res Int. (IF=8.0)｜合工大徐寶才教授團隊破解細胞級抗衰密碼：家禽血“變身”超級抗氧化劑

英文題目：Antioxidant potential of peptides from poultry hemoglobin via probiotic-assisted hydrolysis: Deciphering mechanisms at the cellular level and through molecular dynamics simulations

中文題目：通過益生菌輔助水解從家禽血紅蛋白中提取的肽的抗氧化潛力：分子動力學模擬在細胞水平上解讀機制

發表期刊：Food Research International

影響因子：8.0

作者單位：合肥工業大學

百趣提供服務：多肽組學

活性氧自由基(Reactive Oxygen Species, ROS)的過度積累會導致氧化應激，持續的氧化應激進一步誘發大多數慢性疾病，為了防止自由基對人體的損害，學者們開始研究自由基的作用和保護機制，以進一步了解自由基與疾病的關系，尋找合適的抗氧化劑進行保護。動物血液富含高質量的血紅素鐵和功能性蛋白質，是生物活性肽的寶貴來源，目前對畜禽血液中抗氧化肽的研究主要集中在從血漿蛋白中制備具有抗氧化活性的肽，而對血紅蛋白抗氧化肽的研究則不太常見。在加工工藝方面，大多局限于蛋白酶消化血紅蛋白制品的功能活性，利用益生菌協同蛋白酶水解血紅蛋白制備抗氧化肽的研究鮮有報道，此研究旨在從血紅蛋白中快速篩選抗氧化肽并探討其抗氧化機制。

使用10 kDa和3 kDa超濾膜分離CHHs，得到三個部分:M1 (<3 kDa)、M2 (3 kDa~10 kDa)和M3 (>10 kDa)。通過評價不同餾分的DPPH自由基清除活性、金屬離子螯合能力、羥基自由基清除活性和還原能力，以確定具有最佳抗氧化活性的餾分。觀察到M1餾分具有最高的抗氧化能力，顯著高于其他餾分（圖1）。將M1組分進一步分離成四個峰（圖2），與其他餾分相比，P1餾分具有更好的抗氧化活性。

對P1餾分的肽組成進行了表征，鑒定出了149種肽，肽的長度從6到25個氨基酸不等，超過50%的肽鏈短于10個氨基酸，這些肽來自6種不同的蛋白質（圖3），有研究表明，由2-10個氨基酸組成的短鏈肽，具有更強的抗氧化活性，這可能解釋了P1餾分的優異抗氧化性能。

通過Peptide Ranker服務器、CPP-pred軟件以及BIOPEP-UWM數據庫對生物活性肽進行篩選。結果顯示149個肽片段均無毒性，此外，KLRVDPVNFKLL和GLWGKV都表現出潛在的生物活性和生物可及性得分高于0.5，表明它們可能具有抗氧化活性并在細胞中發揮保護作用。使用BIOPEPUWM數據庫進行功能預測，篩選出了具有抗氧化活性的LIVYPW、GLWGKV兩種肽（圖4）。基于鑒定結果，已知GLWGKV來源于血紅蛋白亞基β，而LIVYPW存在于血紅蛋白亞基β、血紅蛋白亞基ε和血紅蛋白亞基rho中。

Keap1-Nrf2通路在調節細胞內氧化應激中起著關鍵作用。Keap1的Kelch結構域對Nrf2具有特異性結合親和力，這促進了其泛素化和隨后的凋亡，因此，抑制Keap1-Nrf2相互作用可以有效阻止Nrf2的降解，促進下游抗氧化酶的轉錄。對肽GLWGKV(GT)和LIVYPW(LT)與Keap1蛋白進行了分子對接分析。GT和LT都與Kelch結構域中央腔內的關鍵氨基酸殘基（Tyr334、Ser363、Arg380、Asn382、Gln530等）相互作用，顯示出與天然配體相似的結合模式（圖5）。因此，可以推斷這兩種肽的抗氧化途徑可能是由于通過占據Keap1上的Nrf2結合位點而破壞了Keap1-Nrf2相互作用，從而激活了Nrf2信號途徑。

為了進一步探索小分子和蛋白質之間的相互作用，對蛋白質-配體復合物進行了200ns的分子動力學模擬（圖6）：在RMSD曲線中沒有觀察到明顯的不連續性，表明化合物保持穩定地結合在蛋白質囊中而沒有脫離，形成穩定的復合物，從而實現了動態平衡。比較平衡復合物的RMSD漲落，Keap1-GT復合物的RMSD略低于Keap1-LT，表明Keap1與GT的結合比LT更穩定。RMSF用于表征模擬過程中蛋白質鏈中每個氨基酸的構象變化。較大的RMSF值表明氨基酸殘基的構象靈活性較大。根據RMSF圖，在蛋白質-小分子復合物中，只有小部分氨基酸顯示出顯著的構象變化(在殘基380和480附近)，表明GT和LT的加入對Keap1蛋白的整體結構穩定性影響較小，顯示復合物穩定，同時也是觀察到復合物的RMSD值變化最小的主要原因之一。

為了分析由一級和二級位點結合形成的復合物的相對緊密性和穩定性，測量目標蛋白的Rg。Rg值越低，蛋白質結構越緊湊；Rg值越高，結構越無序?；赗g圖，復合物的旋轉半徑減少并達到平衡，表明蛋白質與化合物的結合增強了疏水相互作用和蛋白質內部的有效相互作用，從而提高了復合物的穩定性。為更好地顯示Keap1和肽之間的相互作用，研究者分析了整個模擬過程中蛋白質和小分子之間形成的氫鍵數量的變化。分析顯示GT與Keap1蛋白的氫鍵數量多于LT，意味著Keap1-GT復合物更穩定。通過分析受體和配體結合能的變化，可以清楚地分析相互作用。負的結合自由能值(Gbind)表示系統穩定，結合自由能越低，復合物越穩定。從表1中可看出Keap1-GT復合物比Keap1-LT更穩定?？傊珿T，LT和Keap1蛋白之間的強親和力有助于形成穩定的復合物，這可能是這些肽的抗氧化活性的原因。

對化學合成的LT和GT肽模擬體外胃腸消化。結果顯示（圖7），酶解后二者羥自由基清除活性、金屬離子螯合能力均顯著高于未酶解肽，但LT的DPPH自由基清除能力顯著下降，因胃蛋白酶、胰蛋白酶切割肽鍵有pH依賴性和特異性，推測LT中C端亮氨酸在消化中降解，致使其DPPH自由基清除能力降低。有趣的是，在模擬消化過程中，GT抗氧化活性的整體增強表明，胃腸消化可能會破壞L-位點的肽，產生更小的肽或氨基酸，如G、L和WKV。這些較小的片段可以通過改變連接構象和釋放疏水性氨基酸來增強抗氧化性能。

GT對Caco-2細胞沒有明顯的細胞毒性，且將Caco-2細胞暴露于H?O?中4小時，細胞活力以濃度依賴的方式顯著降低（圖8A）。選擇800 μM的H?O?處理4小時來建立Caco-2氧化應激模型。與模型組相比，用200 μM GT預處理的組別中細胞活力顯著提升，該效果與用200 μM谷胱甘肽(GSH)處理的結果相比無顯著性差異（圖8B）。

為了進一步闡明GT對H?O?誘導的Caco-2細胞氧化損傷的保護機制，對抗氧化酶進行研究，結果表明GT對H?O?誘導的Caco-2細胞氧化損傷的保護作用可能是由于它能夠增強抗氧化酶如SOD、CAT和GSH-Px的活性，以濃度依賴的方式減少MDA的生成而發揮作用。

為進一步闡明肽GT的抗氧化機制，研究了Keap1-Nrf2途徑相關蛋白(Nrf2, HO-1, 和NQO1)，結果顯示當用GT(50、100和200μM)預處理細胞時，這些蛋白的表達顯著增加，且呈劑量依賴性（圖10），表明GT促進了Nrf2核轉位，從而激活了Nrf2信號通路并導致HO-1和NQO1表達上調，分子對接和蛋白質印跡分析的結合證實GT能夠與Keap1相互作用，占據Keap1-Nrf2復合物上的Nrf2結合位點，使Nrf2從復合物中解離出來，轉移到細胞核中，形成Nrf2-Maf異二聚體。一旦進入細胞核，Nrf2-Maf復合物就與ARE序列結合，從而啟動由ARE調節的抗氧化酶基因的轉錄（圖11）。

本研究提出了從血紅蛋白中快速篩選抗氧化肽的策略，并揭示了分子和細胞水平的抗氧化機制。通過詳細了解抗氧化肽的構象關系和抗氧化保護機制，為肽基抗氧化劑的未來發展奠定了基礎，并加速了副產物向營養化的轉變和功能性食品的開發。