隨著國內防疫政策的不斷優化，加強疫苗接種率成為重中之重。僅一周之內，多款新冠疫苗被納入緊急使用。日前，沃森生物也在互動平臺表示，其新冠mRNA疫苗的國內III期臨床試驗數據整理及統計分析工作已進入尾聲，并已向CDE提交海外III期臨床研究首次分析報告，不斷推動國內上市進程。
近岸蛋白在推動mRNA疫苗研發生產過程中不斷探索創新，于近期又新增兩款GMP級限制性內切酶BspQI和XbaI，為客戶提供更多的酶切位點選擇。
在選擇質粒線性化工具時，IIS型限制性內切酶成為mRNA模板制備的好選擇，原因是其酶切位點在識別位點以外，酶切后可將Poly A結構直接暴露在3’端而不產生冗余的酶切位點殘基，從根本上杜絕多余堿基造成的不確定性。BspQI和BsaI作為一種IIS型限制性內切酶，被廣泛應用于mRNA模板制備，其酶切識別位點分別長達7個和6個堿基，具有高度特異性，極不容易在目標序列中出現相同酶切位點，能夠有效避免出現非特異性的酶切。
5’...GCTCTTC(N)1↓...3’
3’...CGAGAAG(N)4↑...5’
圖一：BspQI酶切識別位點
5’...GGTCTC(N)1↓...3’
3’...CCAGAG(N)5↑...5’
圖二：BsaI酶切識別位點
此外，在質粒線性化過程中，還要求酶切產物必須為5’端突出末端，因為如果酶切產生3’突出末端的模板，在體外轉錄（IVT）時，就會增加副產物dsRNA的生成風險，而dsRNA是一類免疫反應的強刺激物，需要嚴格控制，才能保證mRNA疫苗的有效性。質粒線性化中，除了上述兩種酶，XbaI因其可產生5‘端突出序列也常被應用于生產中。
5’...T↓CTAGA...3’
3’...AGATC↑T...5’
圖三：XbaI酶切識別位點
產品特點：
酶切活性高
圖四：M為Marker；1為陰性；2為常規反應體系酶切結果；3為反應體系內buffer調整用量至4μl；4為反應體系內BspQI酶調整用量至0.8μl ；5為反應體系內調整質粒用量至1.5μg。結果無明顯差異，證明酶活性高，可適應反應體系內各組分調整。
圖五：M為Marker；1為500ng底物；2為1μg底物；3為5μg底物；4為7.5μg底物；5為10μg底物；6為15μg底物；7為30μg底物；8為45μg底物；常規反應體系內，近岸蛋白XbaI可以完全酶切15μg底物，證明酶活性高，反應底物可根據具體切割質粒類型靈活調整。
Buffer兼容性好
圖六：M為Marker；1為陰性；2為近岸蛋白BspQI及對應反應Buffer體系；3為N品牌BspQI及對應反應Buffer體系；4為近岸蛋白BspQI與Buffer1反應體系；5為近岸蛋白BspQI與Buffer2反應體系；6為近岸蛋白BspQI與Buffer3反應體系；7為近岸蛋白BspQI與Buffer4反應體系。結果無明顯差異，證明近岸蛋白BspQI適配市面上常見酶切反應Buffer，兼容性好。
熱穩定性好
圖七：左圖為37℃放置0天，右圖為37℃放置7天；泳道1為1ul酶用量，泳道2-6為2倍酶活梯度稀釋，泳道7為陰性，結果顯示BspQI酶活無明顯變化，證明其熱穩定性強。
圖八：左圖為37℃放置0天，右圖為37℃放置7天；泳道1為1ul酶用量，泳道2-6為2倍酶活梯度稀釋，結果顯示XbaI酶活無明顯變化，證明其熱穩定性強。
過夜酶切及甘油濃度變化，無星號活性
圖九：M為Marker；1為陰性；2為N品牌10U BspQI；3為近岸蛋白10U BspQI；4為近岸蛋白20U BspQI；5為近岸蛋白40U BspQI；以lamda-HindIII DNA為底物（底物中含有兩個BspQI酶切位點），過夜酶切（16h），結果顯示近岸蛋白BspQI星號活性極低。
圖十：M為Marker；1為甘油濃度1%，反應1小時；2為甘油濃度1%，反應16小時；3為甘油濃度5%反應16小時；4為甘油濃度10%，反應16小時。結果顯示近岸蛋白XbaI無星號活性。
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目錄號 |
產品名稱 |
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BspQI, GMP Grade |
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GMP-EB057 |
10×BspQI Reaction Buffer, GMP Grade |
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XbaI, GMP Grade |
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GMP-EB015 |
10×XbaI Reaction Reaction Buffer, GMP Grade |
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BsaI, GMP Grade |
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10×BsaI Reaction Buffer , GMP Grade |
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T7 RNA Polymerase, GMP Grade |
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10×Transcription Buffer, GMP Grade |
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Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade |
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mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase, GMP Grade |
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10×Capping Reaction Buffer, GMP Grade |
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SAM (32mM), GMP Grade |
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E. coli Poly(A) Polymerase, GMP Grade |
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10×Poly(A) Polymerase Buffer, GMP Grade |
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Pyrophosphatase, Inorganic （yeast）, GMP Grade |
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RNase Inhibitor, GMP Grade |
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DNase I, GMP Grade |
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T7 RNA Transcription Enzyme Mix, GMP Grade |
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10×Transcription Buffer, GMP Grade |
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ATP, GMP Grade （100mM） |
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ATP, GMP Grade （10mM） |
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GTP, GMP Grade （100mM） |
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GTP, GMP Grade （10mM） |
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CTP, GMP Grade （100mM） |
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UTP, GMP Grade （100mM） |
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N1-Me-Pseudo UTP, GMP Grade |
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Pseudo UTP, GMP Grade |
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eGFP mRNA |
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Luciferase mRNA |
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T7 High Yield RNA Transcription kit |
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Thermostable T7 RNA Polymerase |
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