2019年以來的新型冠狀病毒（2019-nCoV, SARS-CoV-2），目前在全球大流行，截至2022年4月24日全球累計5億多確診病例，已有620多萬人因感染SARS-CoV-2死亡 （來源于https://covid19.who.int/），而逃避宿主免疫的新型冠狀病毒突變株（VOC）的陸續出現，對全球經濟和公共衛生帶來空前的挑戰。新冠疫情發生以來，國際上多個研究小組針對SARS-CoV-2進行了系列藥物研發工作。目前在臨床試驗登記平臺官方網站（clinicaltrials.gov）上有7871份臨床試驗記錄。理想的抗病毒藥物應該針對涉及SARS-CoV-2生命周期的必需蛋白質。 木瓜蛋白酶樣蛋白酶（PLPro）和主蛋白酶（Mpro/3CLpro）是新型冠狀病毒產生的兩種重要的蛋白酶。SARS-CoV-2病毒進入細胞后，核衣殼與病毒自身的正義鏈RNA釋放到細胞質中，正義鏈RNA的開放閱讀框ORF1a和ORF1b翻譯產生非結構蛋白，由PLpro和 Mpro/3CLpro參與裂解，最終產生包括螺旋酶（Helicase）和RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）在內的16種非結構蛋白，參與病毒轉錄、復制過程[1]。PLpro還介導抗病毒蛋白的去泛素化和去ISG化，從而參與調節宿主抗病毒先天免疫[2，3]。因此，抑制PLPro和Mpro/3CLpro能夠有效抑制病毒的感染與復制，是抗病毒藥物研發的關鍵靶點。
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新冠病毒核心酶PLPro
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PLpro位于nsp3，在三個位點切割病毒多聚蛋白pp1a和pp1ab，產生nsp1、nsp2和nsp3。如圖2[4]，PLpro包含一個N端泛素樣結構域（Ubl）和一個催化核心結構域。催化核心結構域包括三個子結構域：拇指（Thumb）、手掌（Palm）和手指（Finger），像張開的右手一樣。底物結合位點位于拇指結構域和手掌結構域之間的溶劑暴露裂縫中，具有由C111、H272和D286組成的催化三元體。底物結合位點識別保守序列LXGG↓X（底物的氨基酸殘基編號為P4-P3-P2-P1↓-P1'，向下的箭頭表示裂解位點）。PLpro的亞位點S1-S4分別為底物的P1-P4提供了結合位點。在催化位點附近有一個6-氨基酸（殘基267-272）的柔性環，稱為封閉環2（blocking loop 2，BL2），在控制底物進入活性位點方面起著重要作用。
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研究者篩選和評價了一批FDA批準的針對SARS和MERS等 PLpro的臨床藥物對SARS-CoV-2 PLpro的適用性，發現一種萘類的非共價抑制劑GRL0617顯示出了很強的抑制活性，IC50約為2.0 μM，EC50約為20 μM，并且在Vero E6細胞的抗病毒實驗中表現出了較好的抑制效果。GRL0617通過占據和封鎖PLpro底物結合口袋S3和S4（圖2），發揮了抑制活性，BL2環向抑制劑方向關閉，干擾肽基序LXGG的識別。而結合位點與PLpro的活性中心無關[4-9]。 隨后，Osipiuk等報道了幾個GRL0617類似物，它們對SARS-CoV-2 PLpro也表現出良好的抑制作用[7]。Ma等報道了兩個優化后的Jun9-75-4和Jun9-72-2，IC50（分別為0.62和0.67μM）和EC50（分別為7.88和6.62μM）比GRL0617低幾倍，從而使它們成為非常有效的PLpro抑制劑[10]。Shen等通過探索GRL0617之外的其他結合位點對GRL0617的效價進行了優化，發現2 -苯基噻吩（phenylthiophene）抑制劑XR8-23和 XR8-24對SARS-CoV-2 PLpro IC50值分別為0.39和0.56μM，在人類肺上皮A549細胞抗病毒感染的EC50值分別為1.4和1.2μM，比GRL0617有很大改進[11]。高通量篩選還發現了一種新的先導藥物YM155，對SARS-CoV-2 PLpro的抑制IC50值為2.47 μM，EC50值為0.17 μM[12]。從組合底物庫中鑒定到的擬肽抑制劑VIR250和VIR251是SARS-CoV-2 PLpro的共價抑制劑，這兩種共價抑制劑對SARS-CoV和SARS-CoV-2 PLpros均表現出良好的抑制作用，對人去泛素酶幾乎沒有交叉反應[13]。GRL0617使BL2保持在一個關閉的構象中，而VIR251則是使BL2穩定在開放構象中，基于此又篩選了幾種具有類似相互作用模式的潛在抑制劑[14，15]。 另外，最近有研究者篩選到了一種具有廣譜抗冠狀病毒活性的非共價先導抑制劑F0213，IC50 值為7.4 μmol/L，EC50 值為4.5 μmol/L，可有效的抑制SARS-CoV、SARS-CoV-2（包括Omicron）、MERS-CoV、hCoV-229E和hCoV-OC43等多種冠狀病毒（圖3）。既能通過阻斷病毒多蛋白裂解來抑制冠狀病毒復制，又能通過拮抗PLpro去泛素酶活性來促進抗病毒免疫，口服給藥的F0213具有一定的臨床應用潛力[16]。
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圖3. F0213對 PLpro的抑制作用
目前，在clinicaltrials.gov可查到兩種PLpro抑制劑已進入臨床研究。一種是用于治療嚴重痤瘡的藥物異維A酸，已在四項臨床試驗中測試其治療新冠病毒的潛力（試驗號為：NCT04361422、NCT04382950、NCT04389580和NCT04353180）。另一種是FDA批準的藥物Ebselen，由于PLpro的半胱氨酸殘基對其酶活性至關重要，Ebselen能與半胱氨酸殘基共價結合，阻斷冠狀病毒PLpro的活性。（試驗號為：NCT04483973和NCT04484025）
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新冠病毒核心酶Mpro/3CLpro
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Mpro位于nsp5，在多聚蛋白1ab上至少有11個裂解位點。Mpro大多數底物的識別順序為Leu-Gln↓(Ser, Ala, Gly) (↓為裂解位點)。底物的氨基酸殘基編號為P4-P3-P2-P1↓-P1 '，Mpro的亞位點S1-S4分別為底物的P1-P4提供了結合位點。上海藥物研究所解析了Mpro的結構（圖4），Mpro的活性形式是同源二聚體，每個原體由三個域組成（結構域I、II和III）。結構域I（殘基8-101）和II（殘基102-184）由反平行的β-桶組成，結構域I和II一起形成類胰凝乳蛋白酶的結構。結構域III（201- 306）主要由5個α-螺旋組成，排列成一個大的球狀簇，結構域III負責二聚化。抑制劑α-ketoamide對MERS-CoV、SARS-CoV和腸道病毒均具有抗病毒作用。兩個化合物11a和11b是α-ketoamide 的衍生物，具有較好的抗病毒活性。另外，解析的化合物11a和11b與主蛋白酶的晶體結構表明，底物結合口袋位于結構域I和II之間的裂口。Mpro識別底物的p4-p1’位置[17]。
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FRET的實驗結果表明，11a和11b具有良好的抑制效果，IC50分別為0.053μM和0.040 μM。在Vero-E6細胞中，對SARS-CoV-2的EC50分別為530 nM和720 nM。且靜脈注射時候，小鼠、大鼠和比格犬表現出良好的藥代動力學性質（圖5）[18]。11a是有望作為抗病毒藥物往前推的，上海藥物研究所官網給出的11a編號為DC402234，轉讓給的前沿公司的編號為FB2001，目前該化合物有2項臨床試驗在進行，試驗號為：NCT04766931和NCT05197179。
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許多已經被發現的Mpro抑制劑表現出一系列的結合機制。這些抑制劑通常是模仿天然肽底物的模擬肽，彈頭主要為Michael受體、醛類和不同類型的酮類等。它們與Mpro中的C145殘基共價結合，發揮抑制作用，應該對冠狀病毒具有普遍的廣譜活性。臨床批準的藥物carmofur[19]和boceprevir[20]被重新利用，對SARS-CoV-2 Mpro表現出低的微摩爾抑制活性。臨床前抑制劑GC376[20]顯示出抑制活性。比較這些抑制劑-Mpro復合物結構，發現除了 carmofo和boceprevir外，這些小分子都與Mpro催化殘基半胱氨酸形成C-S共價鍵，并在P1位置形成內酰胺環，與S1亞位點非常匹配。SARS-CoV-2 Mpro亞位點S2似乎更喜歡疏水相互作用。然而，這些抑制劑的P3位置與S3口袋匹配得不太好。將來可能會進行結構優化，以研究更適合該亞位點的基團。 2021年12月22日，輝瑞宣布美國FDA批準其新型COVID-19口服抗病毒候選藥物Paxlovid 的緊急授權申請（EUA），用于治療非住院、具有發展成重癥疾病高風險成人COVID-19感染。根據EPIC-HR 研究，該藥可以將住院或死亡風險降低89%。輝瑞Paxlovid主要成分之一是PF-07321332。PF-07321332與SARS-CoV-2 Mpro復合物結構（圖6）可見，在SARS-CoV-2 Mpro結構域I和II之間裂隙中的狹長空腔具有多個抑制劑結合位點，其中PF-07321332占據亞位點S1、S2和S4，除了典型的共價相互作用外，PF-07321332還與活性位點形成多種非共價相互作用[21]。
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PF-07321332對所有已知感染人類的冠狀病毒類型的FRET Mpro檢測顯示了有效的抑制作用，其中對SARS-CoV-2 Ki(95%CI)值為3.1nM（圖7）。另外，用兩種與病理相關的細胞模型：表達ACE2的人腺癌來源的肺泡基底上皮細胞（A549）和分化正常的人支氣管上皮細胞（dNHBE）來評估PF-07321332的體外抗病毒活性，EC50分別為77.9nM和61.8nM，表明在兩種細胞模型中PF-07321332對病毒復制都有強烈抑制效果（圖7）。使用小鼠適應SARS-CoV-2的動物模型，評估PF-07321332的體內抗病毒活性，結果證明，在之前體外實驗觀察到的抗病毒濃度下，它在體內也可以有效降低感染鼠肺部病毒濃度，同時能夠明顯改善感染小鼠的多灶性肺部病變（圖7）[22]。
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另外，藥物再利用是藥物發現的重要策略。一些現有的廣譜抗病毒藥物，如雙抑制劑，雙硫侖（disulfiram）/依布硒（ebselen），能同時抑制Mpro和PLpro的水解作用，目前正在進行臨床試驗。隨著SARS-CoV-2的高傳染性在全球范圍內不斷爆發，藥物再利用、新導識別和基于結構的新導優化的綜合應用有望進一步加快研發進程，開發安全的特異性抑制劑?？傊?，盡管已有一些令人鼓舞的結果，但SARS-CoV-2藥物的發現仍遠不能滿足需求。未來的研究仍需努力，最終開發出有前景的臨床藥物。
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Recombinant SARS-CoV-2 3C-like Proteinase/3CLpro (Cat.No.:CR92)
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