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研究背景：NK細(xì)胞在固有免疫和適應(yīng)性免疫中均有重要的作用，Mn²⁺激活cGAS-STING通路，但該機(jī)制對NK細(xì)胞的影響尚不明確。

科學(xué)問題：Mn²⁺如何調(diào)控NK細(xì)胞的激活。

實驗材料：C57BL/6小鼠、NK-92MI細(xì)胞系、人類和小鼠的原代NK細(xì)胞。

表型：Mn²⁺處理顯著抑制小鼠黑色素瘤生長，且NK細(xì)胞在這一過程中受到Mn²⁺調(diào)控。

機(jī)制：Mn²⁺激活NK細(xì)胞中的cGAS-STING通路，激活UTX的表達(dá)，提升NK細(xì)胞的響應(yīng)，直接增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子分泌，并通過NK細(xì)胞間接激活CD8+ T細(xì)胞。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序

（技術(shù)服務(wù)由伯豪生物提供）

1. Mn²⁺的抗腫瘤效應(yīng)依賴于NK細(xì)胞

作者通過向C57BL/6小鼠中注射小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10，構(gòu)建腫瘤模型，分四次腹腔注射MnCl₂，觀察到Mn²⁺處理顯著抑制腫瘤生長，NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等均有顯著增加，NK細(xì)胞具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性（Fig. 1A-D, S1A, B）。

為了探究Mn²⁺抗癌的主要影響因素，作者設(shè)計了Rag1全身性敲除（Rag1^-/-）的免疫缺陷性小鼠，阻斷T細(xì)胞和B細(xì)胞的發(fā)育和分化。在排除了T細(xì)胞和B細(xì)胞的影響后，Mn²⁺的抗腫瘤能力依舊顯著強(qiáng)于對照組，另一方面，Mn²⁺處理組中的NK細(xì)胞的激活水平也顯著高于對照組（Fig. 1F, G）。在使用NK細(xì)胞抑制劑處理后，腫瘤生長顯著上調(diào)，而Mn²⁺的抗腫瘤效應(yīng)下調(diào)（Fig. 1H, I, J）。回補(bǔ)Mn²⁺，有部分CD8+ T細(xì)胞受到激活，腫瘤的生長因此受到部分抑制（Fig. 1I, J, K）。如上結(jié)果暗示了NK細(xì)胞在Mn²⁺介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)中發(fā)揮的關(guān)鍵性作用，以及Mn²⁺在此過程中還可能通過NK依賴或非依賴的方式激活其他類型的免疫細(xì)胞。

2. Mn²⁺直接調(diào)控NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性

考慮到NK細(xì)胞在清除腫瘤細(xì)胞過程中發(fā)揮的重要作用，作者選擇小鼠胰腺和人類PBMC中分離純化出來的NK細(xì)胞，用于探究Mn²⁺對NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性的調(diào)控。結(jié)果表明，Mn²⁺處理不會對NK細(xì)胞的生長和凋亡產(chǎn)生顯著性的影響，但能使得NK細(xì)胞激活marker的表達(dá)水平上調(diào)（Fig. 2A-F）。

隨后，作者選取NK-92MI細(xì)胞系和人類原代NK細(xì)胞，與靶細(xì)胞K562分別以不同的細(xì)胞比例（E:T）進(jìn)行共培養(yǎng)48小時，可見兩種NK細(xì)胞的Mn²⁺處理組的細(xì)胞毒性均有顯著上調(diào)，鼠源NK細(xì)胞和靶細(xì)胞同理可證，即Mn²⁺提高NK細(xì)胞的腫瘤殺傷性（Fig. 3A-H）。

3. Mn²⁺通過NK細(xì)胞增強(qiáng)CD8+ T細(xì)胞的激活

前文提到，Mn²⁺的抗腫瘤效應(yīng)除了可能依賴于對NK細(xì)胞細(xì)胞毒性的直接調(diào)控外，還可能通過NK細(xì)胞進(jìn)一步調(diào)控T細(xì)胞。為了驗證這種可能性，作者檢測了NK細(xì)胞去除的小鼠中CD8+ T細(xì)胞的激活水平，發(fā)現(xiàn)Mn²⁺處理可以讓CD8+ T細(xì)胞激活水平顯著上調(diào)但低于對照組（Fig. 1K）。作者分析了CD45+ 腫瘤浸潤細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq；測序服務(wù)由伯豪生物提供）數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)Mn²⁺處理組中NK細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞及其他一些細(xì)胞類型在數(shù)目和比例上顯著增加，GO和KEGG富集到了NK細(xì)胞中趨化因子和白細(xì)胞遷移等與表型和功能相關(guān)通路的顯著激活，隨后用體外實驗驗證了趨化因子濃度在Mn²⁺處理條件下的變化（Fig. 4A-F）。在Mn²⁺處理條件下，CD8+ T細(xì)胞和NK細(xì)胞共培養(yǎng)時，其激活水平和細(xì)胞毒性相比于無Mn²⁺組均有進(jìn)一步的顯著提升（Fig. 4G-L）。綜上，作者得到結(jié)論：Mn²⁺處理可以通過NK細(xì)胞依賴或非依賴的方式調(diào)控CD8+ T細(xì)胞。

4. Mn²⁺通過cGAS-STING-UTX途徑激活NK細(xì)胞

cGAS-STING途徑在以往的研究中已經(jīng)被報道受到Mn²⁺調(diào)控^[1][2][3]，UTX也被報道在NK細(xì)胞響應(yīng)中具有重要的作用^[4]，而本研究中關(guān)于Mn²⁺調(diào)控NK細(xì)胞的結(jié)果也就成為了連接上述兩個結(jié)論的關(guān)鍵。

首先，作者在STING全身性敲除的小鼠（STING^-/-）中驗證了NK細(xì)胞的增殖和凋亡都不受Mn²⁺調(diào)控，且完全不會被Mn²⁺處理激活；其次，作者在野生型小鼠中分別利用cGAS和STING的抑制劑對cGAS-STING信號通路進(jìn)行抑制，觀察到Mn²⁺處理不會影響NK細(xì)胞的增殖，但NK細(xì)胞的激活水平不再受Mn²⁺處理的顯著上調(diào)（Fig. 5）。

最后，為了驗證UTX在Mn²⁺依賴的NK細(xì)胞激活調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮的作用，作者在scRNA-seq結(jié)果中通過在轉(zhuǎn)錄水平上計算cGAS和STING的表達(dá)水平與UTX表達(dá)水平之間的相關(guān)系數(shù)，推斷出cGAS-STING通路與UTX具有顯著的相關(guān)性，并使用TCGA數(shù)據(jù)庫中的公共數(shù)據(jù)對這一結(jié)論進(jìn)行了驗證，隨后進(jìn)一步通過公共數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了UTX轉(zhuǎn)錄水平和NK細(xì)胞豐度之間具有顯著的正相關(guān)性（Fig. 6A, B）。

Mn²⁺處理能在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)UTX，但這種調(diào)控在STING敲除的NK細(xì)胞中受到明顯的抑制（Fig. 6C, D）。在cGAS或STING抑制劑處理的NK細(xì)胞中過表UTX可以顯著回補(bǔ)激活的NK細(xì)胞占比，反之亦然（Fig. 6E-H）。

綜上，作者驗證了Mn²⁺依賴的cGAS-STING-UTX通路調(diào)控NK細(xì)胞激活的機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

[1]. Hooy RM, Massaccesi G, Rousseau KE, Chattergoon MA, Sohn J. Allosteric coupling between Mn2+ and dsDNA controls the catalytic efficiency and fidelity of cGAS. Nucleic Acids Res. 2020;48(8):4435-4447.

[2]. Wang C, Guan Y, Lv M, et al. Manganese increases the sensitivity of the cGAS-STING pathway for double-stranded DNA and is required for the host defense against DNA viruses. Immunity. 2018;48(4).

[3]. Zhao Z, Ma Z, Wang B, Guan Y, Su X-D, Jiang Z. Mn2+ directly activates cGAS and structural analysis suggests Mn2+ induces a noncanonical catalytic synthesis of 2’3’-cGAMP. Cell Rep. 2020;32(7):108053.

[4]. Cheng MI, Li JH, Riggan L, et al. The X-linked epigenetic regulator UTX controls NK cell-intrinsic sex differences. Nat Immunol. 2023;24(5):780-791.