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類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）是一類自身免疫性疾病，其主要以多關(guān)節(jié)滑膜炎、血管翳形成以及軟骨與骨侵蝕為主要病理表現(xiàn)。生物制劑（bDMARDs）的應(yīng)用讓大部分RA患者受益，但是仍然有30%-40%的患者對多種bDMARDs反應(yīng)較差，揭示了RA中存在潛在的且未被重視的通路和靶點，以及對這些通路和靶點進行深入探索的必要性。與長期處于緩解期的RA患者相比，活動期的RA患者關(guān)節(jié)破壞的風險和進程明顯增加。因此，解析RA患者關(guān)節(jié)局部免疫微環(huán)境在活動期和緩解期的差異性，探索關(guān)節(jié)破壞的發(fā)生過程，對于保護RA患者的關(guān)節(jié)至關(guān)重要。

ScRNA-SEQ，ST

結(jié)合單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 和空間轉(zhuǎn)錄組學，本研究對來自 3 名復(fù)發(fā) RA 患者和 3 名緩解期患者的 6 個匹配的滑膜組織樣本進行了測序。使用 scRNA-seq 鑒定內(nèi)襯和亞襯 FLS 子集；分析了復(fù)發(fā)期和緩解期之間 FLS 子集轉(zhuǎn)錄組的差異。差異分析表明，復(fù)發(fā)性 RA 患者的內(nèi)膜 FLS 中成纖維細胞生長因子 (FGF) 通路高度激活，mIHC 證實 FGF10 表達增加。雖然 I 型干擾素通路也在內(nèi)層 FLS 中被激活，但體外刺激實驗表明它獨立于 FGF10 通路。FLS 中 siRNA 敲低 FGF10 顯著降低 RANKL 的表達。此外，重組 FGF10 蛋白增強了原代人源血管翳細胞培養(yǎng)物中的骨侵蝕，而 FGFR1 抑制劑則減弱了這一過程。最后，施用 FGFR1 抑制劑在 CIA 大鼠模型中顯示出治療效果。

1. 綜合 scRNA-seq 和 ST 分析揭示復(fù)發(fā)和持續(xù)緩解 RA 滑膜的時空景觀

為了研究復(fù)發(fā)和持續(xù)緩解 RA 的潛在病理機制，對來自三名復(fù)發(fā) RA 患者和三名持續(xù)緩解 RA 患者的 6 個滑膜樣本進行了 scRNA-seq，并對 8 個配對樣本（復(fù)發(fā) RA 中的 2 個血管翳樣本和 3 個滑膜樣本以及持續(xù)緩解 RA 中的 3 個滑膜樣本）進行了ST測序。經(jīng)過數(shù)據(jù)預(yù)處理和嚴格的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制后，獲得了來自復(fù)發(fā) RA 患者 (n=3) 的 22,925 個細胞和來自持續(xù)緩解 RA 患者 (n=3) 的 32,236 個細胞用于進一步分析。首先進行了聚類分析，確定了 25 個簇，包括成纖維細胞（6 個簇）、內(nèi)皮細胞（4 個簇）、骨髓細胞（5 個簇）、自然殺傷（NK）細胞（2 個簇）、肥大細胞（1 個簇）、B 細胞 （4個簇）、CD8+ T 細胞、CD4+ T 細胞和使用已建立的細胞標記基因的增殖細胞（圖 1B）。在滑膜細胞分數(shù)中觀察到復(fù)發(fā)組和緩解組之間的顯著差異。我們發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性 RA 中的 CD55+ 襯里成纖維細胞 (FB L-CD55)、T 細胞和 NK 細胞比緩解期的 RA 中高度富集（圖 1C ）。同時分析了八個樣品的 ST 數(shù)據(jù)。我們使用無人監(jiān)督的集群來分析血管翳和滑膜，并按細胞類型進行注釋（圖 1D）。我們發(fā)現(xiàn)位于血管翳內(nèi)層的 CD55+ 內(nèi)層成纖維細胞數(shù)量豐富（圖 1E）。

2. 復(fù)發(fā)和緩解 RA 的 FLS 子集顯示出不同的激活途徑

鑒于 FLS 在 RA 發(fā)病機制中的關(guān)鍵作用，研究特別關(guān)注 FLS 亞群在 RA 復(fù)發(fā)和緩解中的作用。經(jīng)過質(zhì)量控制，獲得了 22,679 個高質(zhì)量的 FLS，根據(jù)差異表達基因 (DEG) 將其分為四個子集：CD55+ 襯里成纖維細胞 (FB L-CD55)、CXCL12+ 亞襯成纖維細胞 (FB S-CXCL12)（圖 2A 和 C） 、MFAP5+ 亞襯成纖維細胞 (FB S-MFAP5) 和 VEGFA+ 亞襯成纖維細胞 (FB S-VEGFA)（圖 2A）。通過整合單細胞測序數(shù)據(jù)和公共數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，觀察到復(fù)發(fā)性 RA 中 CD55+ 內(nèi)襯成纖維細胞的比例很高，這表明內(nèi)膜成纖維細胞在復(fù)發(fā) RA 中顯著增殖（圖 2B）。通過對DEG 進行聚類來生成熱圖，以深入了解復(fù)發(fā)和緩解 RA 中 FLS 的四個子集的分子特征差異（圖 2D）。發(fā)現(xiàn) FB L-CD55 和 FB S-CXCL12 在復(fù)發(fā)和緩解 RA 之間存在顯著差異。FB L-CD55 表達與基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP) 和脂多糖結(jié)合蛋白 (LBP) 相關(guān)的基因， MMP加速軟骨降解， LBP表明復(fù)發(fā) RA 中先天免疫反應(yīng)的上調(diào)（圖 2D）。FB S-CXCL12 在復(fù)發(fā)性 RA 中表達與 MHC II 類呈遞和補體激活途徑 (C3) 相關(guān)的基因（圖 2D）。接下來，研究基于 Hallmark 和 Reactome 數(shù)據(jù)集對 FLS 子集進行了通路分析（圖 2E）。發(fā)現(xiàn)，來自復(fù)發(fā)性 RA 的 FB L-CD55 中的干擾素 α (IFN-α)、干擾素 γ (IFN-γ) 和成纖維細胞生長因子受體 1 (FGFR1) 通路高度激活。在緩解期 RA 中，F(xiàn)B L-CD55 和 VEGFA+ 成纖維細胞 (FB S-VEGFA) 中高度富集凋亡和缺氧途徑。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)LS 亞群具有不同的基因表達模式，受不同的復(fù)發(fā)和緩解 RA 途徑調(diào)節(jié)。

3. FGF10-FGFR1信號通路在復(fù)發(fā)性RA的內(nèi)層FLS中異常激活

CellChat 分析顯示，F(xiàn)B L-CD55 與復(fù)發(fā) RA 中的其他 FLS 子集具有強烈的 FGF 信號通路相互作用（圖 3A）。此外，研究觀察到 FGF10-FGFR1 對在復(fù)發(fā) RA 的 FB L-CD55 中高度激活（圖 3B，左）。對于亞襯FLS，F(xiàn)GF7-FGFR1 對占主導(dǎo)地位；然而，復(fù)發(fā)和緩解 RA 之間沒有明顯差異（圖 3B，右）。對不同 FLS 亞群中 FGF7、FGF10 和 FGF14 轉(zhuǎn)錄組表達水平的進一步分析表明，F(xiàn)GF10 在復(fù)發(fā) RA 的 FB L-CD55 細胞中高表達（圖 3C）。使用 mIHC，研究確認 PDPN+FGF10+ FLS 主要在復(fù)發(fā) RA 的血管翳內(nèi)層中檢測到（圖 3D）。通過 IHC 對復(fù)發(fā)和緩解 RA 患者的 12 個血管翳樣本中的 FGF10 表達進行定量分析顯示，復(fù)發(fā) RA 患者中 FGF10 陽性區(qū)域的比例顯著高于緩解 RA 患者（圖 3E 和 F）。通過結(jié)合 scRNAseq 和 IHC 數(shù)據(jù)，證明了復(fù)發(fā) RA 內(nèi)膜 FLS 中 FGF10-FGFR1 信號通路的過度激活。

4. IFN-α和FGFR1信號通路在復(fù)發(fā)性RA中很大程度上是獨立的

鑒于 IFN-α 和 FGFR1 信號通路主要在復(fù)發(fā) RA 的內(nèi)層 FLS 中激活，本研究探討了這兩種通路之間是否存在交叉調(diào)節(jié)。首先，通過比較來自 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的 FLS 中的兩個通路評分來進行相關(guān)性研究。未觀察到 IFN-α 和 FGFR1 信號通路與總 FLS 或復(fù)發(fā)或緩解 RA 的 FLS 之間存在任何已建立的相關(guān)性 (R>0.3)（圖 4A 和 B）。這些結(jié)果表明這兩條途徑在單細胞水平上很大程度上是獨立的。

為了證實這些發(fā)現(xiàn)，進行了體外刺激實驗。用重組人干擾素α2a（IFN-α2a）或FGF10蛋白刺激MH7A FLS細胞系6小時，并通過qRT-PCR測量目標分子。與未刺激的對照組相比，IFN-α2a刺激MH7A FLS細胞系以劑量依賴性方式誘導(dǎo)了預(yù)期的IFI6和ISG15 mRNA表達；然而，沒有觀察到 FGF10 mRNA 的顯著變化（圖 4C）。同時，用 10 ng/ml 和 100 ng/ml FGF10 刺激 MH7A FLS 細胞系對 IFI6 和 ISG15 mRNA 的表達幾乎沒有影響（圖 4D）。總的來說，本研究提供了初步證據(jù)表明 IFN-α 和 FGFR1 信號通路不太可能相互交叉調(diào)節(jié)。

5. 襯里 FLS 中的 IFN-α 和 FGFR1 信號通路與復(fù)發(fā) RA 中的不同代謝通路存在差異相關(guān)

既往對RA和OA滑膜成纖維細胞代謝的研究表明，缺氧和糖酵解是RA滑膜成纖維細胞的特征。研究觀察到復(fù)發(fā)和緩解 RA 中的 FLS 亞群表現(xiàn)出不同的代謝活動（圖 5A）。在襯里成纖維細胞（FB L-CD55）中高度富集的代謝途徑中，花生四烯酸代謝、亞油酸代謝、氧化磷酸化、泛酸和CoA生物合成在復(fù)發(fā)性RA中占主導(dǎo)地位。相比之下，煙酸鹽和煙酰胺代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝以及糖酵解/糖異生在 RA 緩解中普遍存在。

相關(guān)分析顯示，IFN-α信號通路與亞油酸、α-亞麻酸和花生四烯酸代謝密切相關(guān)（圖5B和C）。相反，F(xiàn)GFR1信號通路與代謝通路的相關(guān)性較小，與賴氨酸降解和粘蛋白型O-聚糖生物合成的相關(guān)性較弱（圖5B和D）。這些數(shù)據(jù)表明 IFN-α 和 FGFR1 信號通路與復(fù)發(fā)性 RA 襯里 FLS 中的不同代謝通路相關(guān)。

6. 阻斷 FGFR1 信號通路可減輕體外骨侵蝕，并在大鼠關(guān)節(jié)炎模型中顯示治療效果

研究進行 Transwell 侵襲實驗來探討 FGF10/FGFR1 信號在 FLS 侵襲性中的潛在作用。與siNC和siFGF7相比，siFGF10顯著抑制FLS的侵襲能力（圖6A和B）。通過蛋白質(zhì)印跡進一步測量了與 FLS 侵襲性相關(guān)的幾種基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)。結(jié)果顯示，與siFGF7和siNC相比，siFGF10顯著抑制MMP2的表達（圖6C和D）。基于此，假設(shè) FGF10/FGFR1 信號傳導(dǎo)促進復(fù)發(fā)性 RA 中 FLS 的侵襲性，并且 MMP2 參與了這一過程。除了MMP2之外，發(fā)現(xiàn)與siFGF7和siNC相比，siFGF10強烈抑制RANKL的表達（圖6C和D），這表明FGF10/FGFR1途徑可能參與復(fù)發(fā)性RA的破骨細胞生成。?