在第7天，HCP (M)、HCP (H) 和DDP 組的腫瘤體積較低（圖2A ）。在第14天，HCP（M）和HCP（H）組的腫瘤體積顯著低于其他組，并且隨著劑量的增加，腫瘤體積有減小的趨勢（圖2B）。在第21天，HCP (H) 組的腫瘤重量和體積顯著下降（圖2C、D）。在治療的21天期間，所有組的體重都有增加的趨勢（圖2E）。治療21天后，HCP（H）組的體重變化明顯低于對照組（圖2F）。HCP（L）、HCP（M）、HCP（H）和DDP組在治療后腫瘤抑制率（IRs）分別為6.51%、14.58%、29.38%和36.40%。治療21天后，各組之間的肝臟或腎臟指標沒有顯著差異（圖2G、H）。

解剖過程順利，腫瘤可完全分離?？梢郧宄貐^分腫瘤組織和周圍組織。腫瘤質地較硬，邊界清晰。模型組的體積高于其他組。切片并用H＆E染色后，癌細胞大且異形，細胞核大且染色強烈。模型組腫瘤細胞排列緊密，細胞核多，形態清晰。DDP組腫瘤細胞分布較松散，細胞相對較少。與模型組相比，HCP處理組異常細胞相對較少，細胞密度較松散（圖2I）。觀察各組肝組織切片。每組小鼠的肝小葉是完整的，肝細胞沒有放大，細胞核定位在中間，細胞間隙清楚，而且沒有明顯的異常（圖2J）。各組腎組織切片未見明顯病理改變。腎小球中發生病變的膜細胞或內皮細胞沒有增加（圖2K）。

Western印跡表明HCP（H）組波形蛋白和N-鈣粘蛋白水平顯著低于模型組。HCP (M)、HCP (H) 和DDP組的蝸牛水平顯著降低。HCP（H）和DDP組的E-鈣粘蛋白水平增加（圖3A、B）。蛋白質芯片數據表明 14 種蛋白質表現出差異表達（4 種下調和10種上調）（圖3C）。上調的蛋白質之一是GREM1，它由GREM1基因編碼，與癌轉移密切相關。高通量測序揭示了1121個差異表達的基因（441個下調和680個上調）（圖3D）。Rap1 信號通路表明，GREM1表達受 miR-205-5p 調節（圖3E）。因此，HCP通過調節Rap1信號通路發揮抗腫瘤作用，GREM1是NSCLC轉移的重要治療靶點。

使用CCK-8測定評估GREM1對A549細胞增殖的影響。A549細胞中的OE-GREM1沒有顯著抑制或促進增殖（圖4A）。用shGREM1轉染A549細胞時，觀察到相同的結果（圖 5A）。使用傷口愈合和Transwell測定探索了GREM1對轉移的影響。OE-GREM1顯著增加了A549細胞的遷移和侵襲（圖4B、C）。當用shGREM1轉染A549細胞時，遷移和侵襲顯著減少（圖5B 、C）。這些數據證實GREM1促進了NSCLC細胞的轉移，并沒有顯著增加細胞增殖。

為了進一步探索GREM1對轉移影響的潛在機制，作者研究了其在EMT中的作用。隨著GREM1表達的增加，間充質標志物（包括波形蛋白、Snail 和N-鈣粘蛋白）的蛋白質水平顯著增加。相比之下，上皮標志物E-鈣粘蛋白的水平急劇下降（圖4D）。在用shGREM1處理的A549細胞中，間充質標志物的表達被抑制，上皮標志物的表達顯著增加（圖5D）。因此，GREM1可能通過促進EMT進展來促進NSCLC的遷移和侵襲。作者進一步研究了Rap1相關信號通路組分（Rap1、c-raf 和 erk1/2）在NSCLC中響應GREM1的變化。結果發現GREM1過表達顯著增加了Rap1通路中信號蛋白相關基因的表達（圖4D），反之亦然（圖5D）。因此，這些結果表明GREM1在Rap1通路的調節中起重要作用，并可能通過激活該通路促進NSCLC的轉移。

圖4 OE-GREM1通過Rap1途徑調節EMT進展，促進A549細胞轉移

圖5 ShGREM1通過Rap1通路調節EMT進展來影響A549細胞的轉移