發表期刊：Angewandte Chemie International Edition
影響因子：12.959
合作客戶：中山大學
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01.研究簡介
金屬類藥物順鉑是對抗腫瘤的一線武器。科學家們一直在致力于提高鉑類藥物的抗癌效果并減少其副作用。其中鉑(IV)前藥修飾的軸向配體可以與鉑(II)藥物協同的方式提高療效，包括調節親脂性和動力學，釋放多種生物活性物質，抑制DNA修復途徑等。缺氧和酸性微環境是實體瘤的主要特征，在促進腫瘤生長、血管生成和轉移方面發揮著重要作用。缺氧和低酸堿度會影響大多數化療藥物的穩定性、滲透性和生物過程，從而降低其抗癌效果。因此，開發能夠克服缺氧和調節微環境的新型鉑類藥物具有深遠的臨床意義和應用價值。
碳酸酐酶IX (CAIX)是一種跨膜蛋白，在發育中的侵襲性腫瘤組織中過度表達，負責調節細胞內外的pH平衡。抑制CAIX不僅是調節腫瘤組織特有的缺氧和酸性微環境的有效途徑，還能干擾腫瘤代謝。
中山大學的毛宗萬課題組在相關的研究工作中，對作為鉑(IV)前體藥物的軸向配體引入了CAIX抑制劑(CAIXplatin)（圖1），旨在調節腫瘤微環境和代謝，以增強鉑類藥物對腫瘤的治療效果。
02.設計優勢
1. CAIXplatins可顯著促進癌癥特異性靶向，使得對正常細胞系具有極低的毒性(IC50 >100μM，72 h)，并且在缺氧條件下癌癥選擇性指數(SI)比順鉑/奧沙利鉑高70~90倍；
2. CAIXplatins對CAIX具有強親和力和抑制活性，可以克服缺氧和酸性微環境，產生高效的抗轉移和抗血管生成活性；
3. CAIXplatins還可以干擾負責能量供應和生物大分子合成的低氧癌細胞的代謝途徑，顯著增強低氧腫瘤的治療效果。
03.研究結果
1. 以順鉑和奧沙利鉑為核心的Pt1和Pt2的CAIXplatins開發
軸向配體L被設計為含有苯磺酰胺（CAIX抑制劑的常見活性部分），以順鉑和奧沙利鉑為核心開發了Pt1和Pt2的CAIXplatins（圖3）。其結構通過元素分析、電噴霧質譜、1H、13C、195Pt核磁共振和高效液相色譜進行表征。對Pt1和Pt2 的還原性研究中，發現Pt1 (8.576min)的HPLC信號隨著對應于L (7.813min)軸向釋放的峰的出現而降低，并且幾乎所有Pt1在1小時內降低。表明鉑(IV)化合物可以有效地減少鉑(II)藥物的釋放，Pt2在血液循環中可能比Pt1更穩定。
2. 細胞毒性、抗轉移和血管生成作用等藥物有效性的指標檢測
作者使用順鉑/奧沙利鉑作為陽性對照，通過MTT法(72 h)評估了L、Pt1和Pt2對各種癌細胞系(三陰性乳腺癌MDA-MB-231、HeLa、HepG2)和正常細胞系的體外細胞毒性。在常氧(20% O2)條件下，Pt1和Pt2對癌細胞株均表現出中等細胞毒性，這與順鉑/奧沙利鉑相似。然而，Pt1和Pt2對正常細胞系的細胞毒性極低(IC50 > 100μM)，癌癥選擇性指數(SI)比順鉑/奧沙利鉑高8倍（表1）。Pt1和Pt2的癌癥選擇性指數在缺氧時顯著升高，比順鉑/奧沙利鉑的SI高70~90倍。這些結果表明，Pt1和Pt2可以克服缺氧，從而選擇性地殺死缺氧癌細胞。
Pt1和Pt2在缺氧的MDA-MB-231細胞(1% O2)中的抗轉移和抗血管生成作用相關的實驗，如傷口愈合試驗，圖4A-B所示，使用Pt1和Pt2處理(5μM，24h)時，細胞遷移被顯著抑制了81.2%和77.0%，而在相同條件下用順鉑和奧沙利鉑處理僅抑制了27.1%和4.5%。這表明Pt1和Pt2具有顯著的抗轉移活性。同時，Western blotting (圖4C)結果表面Pt1和Pt2能夠以劑量依賴的方式顯著降低缺氧的MDA-MB-231細胞(1% O2)中血管內皮生長因子的表達水平。
表1 受試化合物對癌細胞系和正常細胞系的細胞毒性
3. 在體外試劑盒和細胞水平上研究Pt1和Pt2對CAIX的抑制作用
在體外試劑盒檢測實驗中，使用人CAIX作為酶源，4-NPA作為底物，Pt1和Pt2都可以有效地抑制CAIX活性（圖5A）。在缺氧的MDA-MB-231細胞(1% O2)中，CAIX的表達不受順鉑/奧沙利鉑的影響，但被Pt1和Pt2以劑量依賴性方式顯著抑制，并且Pt2的抑制效果優于Pt1(圖5B)。
為了研究CAIX在維持缺氧和酸性微環境中的作用，作者對MDA-MB-231細胞的胞外pH值和O2含量進行了檢測。如圖5D-E所示，低氧細胞(1% O2)在Pt1和Pt2 (10 μM)處理后，RDDP紅色熒光基本上被淬滅，表明細胞O2濃度增加，同時發現HIF-α表達水平降低。細胞O2含量不受順鉑或奧沙利鉑的影響，Pt1和Pt2主要通過CAIXi的作用而不是鉑(II)的作用來克服缺氧。在缺氧（1% O2）條件下培養的MDA-MB-231 細胞pHe值比常氧（20% O2）條件下低，表明缺氧和癌細胞的細胞外酸化之間存在正相關（圖5C）。以上這些結果表明，Pt1和Pt2能有效結合CAIX并抑制其活性，從而克服缺氧并減弱缺氧癌細胞的細胞外酸化，這有助于提高其抗轉移和抗血管生成活性。
4. 應用iTRAQ標記定量蛋白組技術（由百趣生物提供）研究Pt1/Pt2影響蛋白表達量的變化
從Pt1和Pt2細胞處理組中篩選出差異表達的蛋白質。在Pt1處理組中有174個上調和112個下調的蛋白質，而在Pt2處理組中下調蛋白為102個，下調蛋白有221個。GO分析（圖6A）結果表明這些差異表白主要參與氧化還原和生物分子代謝過程。EGCC途徑分析（圖6C）發現在Pt1和Pt2處理的細胞中有幾個重要的代謝途徑受到擾動。如糖酵解/糖異生、碳代謝和缺氧誘導因子1信號通路都存在糖酵解相關關鍵蛋白的下調，導致乳酸和ATP的減少。在Pt1和Pt2處理的低氧癌細胞中，氧化磷酸化途徑也被抑制。此外，嘧啶代謝和氨基酸生物合成也受到嚴重影響，導致生物合成原料嚴重短缺。這些蛋白質組學分析結果表明Pt1和Pt2不僅能調節缺氧和酸性微環境，而且能顯著影響缺氧癌細胞的代謝功能，特別是能量供應和生物大分子合成的相關功能。
5. 動物實驗：評估CAIXplatin體內抗腫瘤效果
選擇具有80mm3體積MDA-MB-231腫瘤的BALB/c裸鼠進行體內抗腫瘤效果研究。他們被隨機分成5組(n = 4)進行尾靜脈注射(i.v. 120μL, 5 mg kg-1)賦形劑和各種鉑類藥物。每3天測量一次腫瘤體積和小鼠重量，24天后處死所有小鼠并收集各組中的腫瘤(圖7A-B)。發現在連續四次注射后，與對照組相比，Pt1和Pt2組可分別抑制腫瘤生長57.9%和65.3%，而順鉑和奧沙利鉑組僅抑制腫瘤生長43.4%和32.0%，因此體內抗癌效果為Pt2 > Pt1 >順鉑>奧沙利鉑。在注射各種鉑類藥物(靜脈注射120μL，5 mg kg-1)24h后，使用免疫熒光測定法測量腫瘤組織中CAIX和CD31(血管生成標記物)的表達水平。與對照組相比，CAIX(綠色)和CD31(紅色)的熒光不受順鉑或奧沙利鉑的影響，但在Pt1和Pt2處理后基本上被抑制(圖7C)。結合前面的實驗，Pt1和Pt2已被證明具有顯著的抗腫瘤效果和抗血管生成活性。
04.文章小結
作者設計了CAIX靶向鉑（IV）前藥Pt1和Pt2并對其抗腫瘤效果進行評價，它們不僅能有效地殺死低氧癌細胞，具有比順鉑/奧沙利鉑高70~90倍的癌癥選擇性指數，而且能重塑腫瘤微環境和代謝，從而有效地抑制腫瘤細胞增殖、轉移和血管生成，體內研究進一步證明，與順鉑/奧沙利鉑相比，Pt1和Pt2對MDA-MB-231腫瘤具有更好的抗癌效果，同時極大地消除了鉑類藥物的副作用，如肝毒性、腎毒性和耳毒性。因此，本研究提出CAIX靶向介導的微環境和代謝調節可作為克服鉑類藥物在治療低氧和侵襲性腫瘤中的非選擇性、低治療效率和嚴重副作用的新方法。
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