期刊：Cellular & Molecular Immunology
影響因子：19.8
通訊單位作者：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)白麗等
伯豪技術(shù)服務(wù)：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
導(dǎo)語(yǔ)
肝細(xì)胞癌（HCC）是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，其免疫微環(huán)境的復(fù)雜性是導(dǎo)致免疫治療療效異質(zhì)性的關(guān)鍵因素。黏膜相關(guān)恒定T細(xì)胞（MAITs）在人類肝臟中高度富集，但其在HCC中的作用存在“抗腫瘤”與“促腫瘤”的長(zhǎng)期爭(zhēng)議。這種爭(zhēng)議很大程度上源于MAIT細(xì)胞的功能異質(zhì)性和可塑性——傳統(tǒng)的群體水平分析難以區(qū)分不同MAIT亞群的獨(dú)特貢獻(xiàn)。
近日，中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)白麗、張慧敏、王華、劉連新、傅思成及安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院錢葉本為共同通訊在Cellular & Molecular Immunology 在線發(fā)表題為“MAIT cell plasticity generates CD4+ MAIT cells that promote HCC progression via metabolic crosstalk with tumor cells”的研究論文。利用單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq） 技術(shù)，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)、體外功能實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型，系統(tǒng)揭示了MAIT細(xì)胞可塑性產(chǎn)生的CD4? Th17極化亞群通過代謝串?dāng)_促進(jìn)HCC進(jìn)展的新機(jī)制。本文將從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的視角，深度解析該研究中RNA-seq分析如何破解MAIT細(xì)胞異質(zhì)性難題，并為腫瘤免疫代謝提供全新見解。
技術(shù)服務(wù)
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
（技術(shù)服務(wù)由伯豪生物提供）
主要研究
1. 單細(xì)胞測(cè)序精準(zhǔn)解析肝癌中MAIT細(xì)胞的亞群異質(zhì)性
研究團(tuán)隊(duì)首先對(duì)7例未經(jīng)治療的HCC患者的腫瘤組織及配對(duì)癌旁組織中分選的T細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序（10x Genomics平臺(tái)）。經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制和聚類分析，他們鑒定出多個(gè)T細(xì)胞亞群，其中MAIT細(xì)胞（定義為CD3E? SLC4A10? ZBTB16? RORC?）主要聚集在cluster 6和cluster 14 （Supplementary Fig. 3a, b）。
為了進(jìn)一步解析MAIT細(xì)胞的內(nèi)部異質(zhì)性，研究者對(duì)MAIT細(xì)胞進(jìn)行了基于差異表達(dá)基因的再聚類。結(jié)果令人振奮：MAIT細(xì)胞被明確分為三個(gè)轉(zhuǎn)錄組特征迥異的亞群：CD4? MAIT簇、CD8? MAIT簇和雙陰性（DN）MAIT簇 （Supplementary Fig. 3c, d）。熱圖顯示，這些亞群具有獨(dú)特的基因表達(dá)譜 （Supplementary Fig. 3e）。
2. 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示CD4? MAIT細(xì)胞的Th17極化特征
CD4? MAIT亞群最顯著的特征是高表達(dá)Th17相關(guān)基因。如圖1F所示，與CD8? MAIT和DN MAIT相比，CD4? MAIT簇中IL17A、IL17F、IL1R1、IL6R、IL23R、IL21、ICOS、AHR和HIF1A的表達(dá)水平顯著升高。更令人信服的是，研究團(tuán)隊(duì)利用另一獨(dú)立發(fā)表的scRNA-seq數(shù)據(jù)集（Zheng et al., Cell 2017）進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示CD4? MAITs（CD3E? SLC4A10? CD4? CD8A?）同樣表現(xiàn)出更高的Th17特征基因表達(dá) （Fig. 1G）。這種跨數(shù)據(jù)集的重復(fù)性驗(yàn)證充分體現(xiàn)了單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)的可重復(fù)性和生物學(xué)穩(wěn)健性。
此外，研究者將單細(xì)胞數(shù)據(jù)與TCGA大樣本bulk RNA-seq數(shù)據(jù)相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)CD4? MAIT特征基因（包括CD4、SLC4A10、KLBR1、NCR3等）與Th17相關(guān)基因在HCC腫瘤樣本中呈顯著正相關(guān)（Pearson相關(guān)系數(shù)顯示高度一致性） （Fig. 1E）。這一從單細(xì)胞到群體水平的跨尺度分析，有力證明了CD4? MAIT亞群在肝癌中的Th17極化特性，而這一結(jié)論在傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)中僅能通過少數(shù)表面標(biāo)記間接推斷。
圖1. CD4? MAIT是人類HCC中主要的IL-17A來源
3. 單細(xì)胞TCR追蹤與擬時(shí)序分析揭示MAIT細(xì)胞分化軌跡
MAIT細(xì)胞是否具有譜系可塑性？CD4? MAIT從何而來？為回答這一問題，研究者利用了scRNA-seq數(shù)據(jù)中的T細(xì)胞受體（TCR）信息。通過分析已發(fā)表的單細(xì)胞數(shù)據(jù)，他們發(fā)現(xiàn)在同一患者的腫瘤和癌旁組織中，CD4? MAITs與CD8? MAITs共享完全相同的TCRβ克隆型 （Fig. 2E）。這一結(jié)果強(qiáng)有力地證明：CD4? MAITs并非一個(gè)獨(dú)立的發(fā)育譜系，而是由CD8? MAITs在腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)下分化而來。
進(jìn)一步的擬時(shí)序（pseudotime）軌跡分析（使用Monocle 2等算法）直觀地展示了MAIT細(xì)胞的分化動(dòng)態(tài)。如圖2F-H所示，基于研究團(tuán)隊(duì)自己的scRNA-seq數(shù)據(jù)（Supplementary Fig. 3），CD4? MAITs主要位于分化軌跡的末端，而CD8? MAITs和DN MAITs則處于更早期或中間位置。這一計(jì)算生物學(xué)方法無需干擾細(xì)胞自然狀態(tài)，即可推斷細(xì)胞分化路徑，是單細(xì)胞測(cè)序獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)。結(jié)合體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)（圖2A-D），單細(xì)胞數(shù)據(jù)為“CD8? MAIT → DP MAIT → CD4? MAIT”的轉(zhuǎn)分化模型提供了強(qiáng)有力的轉(zhuǎn)錄組學(xué)支持。
圖2. CD4? Th17極化MAIT由CD8? MAIT分化而來
4. 整合分析：從單細(xì)胞特征到臨床預(yù)后關(guān)聯(lián)
單細(xì)胞測(cè)序的最終價(jià)值在于將分子特征與臨床意義相連接。研究者提取了CD4? Th17極化MAIT的特征基因集（包括CD4、SLC4A10、ZBTB16、AHR、PKM、IL23R、CTLA4、IL17A等），在TCGA的批量RNA-seq數(shù)據(jù)中進(jìn)行相關(guān)性分析和生存分析。
結(jié)果顯示，該特征基因集的表達(dá)水平與脂質(zhì)儲(chǔ)存相關(guān)基因（PPARA、ABCA12、FABP52、ELOVL4等）呈顯著正相關(guān) （Fig. 4J），與免疫抑制細(xì)胞特征基因（Treg、耗竭T細(xì)胞、MAITreg、MDSC）也呈正相關(guān) （Fig. 4K-N）。更重要的是，高表達(dá)CD4? Th17極化MAIT特征基因的HCC患者，其總生存期顯著縮短（Log-rank檢驗(yàn)，P < 0.0001） （Fig. 4O）。這一從單細(xì)胞數(shù)據(jù)挖掘到人群預(yù)后驗(yàn)證的分析流程，為CD4? MAITs的促癌作用提供了臨床層面的有力證據(jù)。
此外，研究者還利用TCGA數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)Th17相關(guān)基因與MK167（增殖標(biāo)記）及PPARA脂質(zhì)儲(chǔ)存基因的正相關(guān)關(guān)系 （Fig. 3S, T），并繪制了Kaplan-Meier曲線，證實(shí)高表達(dá)Th17基因或脂質(zhì)儲(chǔ)存基因的患者預(yù)后更差 （Fig. 3U, V）。這些分析充分展示了單細(xì)胞測(cè)序與公共數(shù)據(jù)庫(kù)整合的生物信息學(xué)范式。
圖4. CD4? Th17極化MAIT與HCC腫瘤進(jìn)展正相關(guān)
5. 單細(xì)胞測(cè)序揭示CD4? MAIT中AHR及糖酵解基因的協(xié)同上調(diào)
研究者進(jìn)一步利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)探索CD4? MAITs功能極化的上游調(diào)控機(jī)制。差異表達(dá)分析顯示，與CD8? MAITs或DN MAITs相比，CD4? MAIT簇中AHR（芳基烴受體）基因表達(dá)顯著上調(diào) （Fig. 6A, B）。同時(shí)，糖酵解相關(guān)基因集（包括SLC2A1、HK2、PFKL、PKM、ENO1、ALDOA等）在CD4? MAIT中也呈現(xiàn)一致的高表達(dá)模式 （Fig. 6G, H）。來自Zheng實(shí)驗(yàn)室的單細(xì)胞數(shù)據(jù)同樣驗(yàn)證了這一發(fā)現(xiàn) （Fig. 6H）。
為了量化這些差異，研究者從健康供者外周血中分選出CD4? MAITs、CD8? MAITs和DN MAITs，通過qPCR驗(yàn)證了單細(xì)胞測(cè)序的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：CD4? MAITs中HK2、HK3、PFKL、PFKP、PKM1/2、ENO1、ALDOA、ALDOC及SLC2A1的mRNA水平均顯著高于其他亞群 （Fig. 6I）。這種“單細(xì)胞發(fā)現(xiàn) + 靶向驗(yàn)證”的策略，最大程度地避免了假陽(yáng)性，體現(xiàn)了單細(xì)胞測(cè)序作為探索性工具的強(qiáng)大功能。
圖6. 腫瘤細(xì)胞分泌的犬尿氨酸通過AHR起始CD4? Th17極化MAIT的糖酵解和IL-17A分泌
結(jié)語(yǔ)
該研究之所以能夠精準(zhǔn)定義肝癌中MAIT細(xì)胞的三個(gè)功能亞群、揭示CD4? MAIT的Th17極化特征、追蹤其從CD8? MAIT轉(zhuǎn)分化的譜系軌跡，并發(fā)現(xiàn)AHR與糖酵解基因的協(xié)同上調(diào)，關(guān)鍵在于**高質(zhì)量的單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)。從獨(dú)立數(shù)據(jù)集的交叉驗(yàn)證，到TCR克隆型共享分析，再到擬時(shí)序分化重建，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)貫穿了從“發(fā)現(xiàn)”到“驗(yàn)證”再到“臨床關(guān)聯(lián)”的完整證據(jù)鏈。正是單細(xì)胞分辨率下對(duì)轉(zhuǎn)錄組的無偏倚解析，才使研究者得以突破傳統(tǒng)群體分析的局限，捕捉到MAIT細(xì)胞可塑性的真實(shí)面貌。對(duì)于腫瘤免疫微環(huán)境等高度異質(zhì)性的研究領(lǐng)域，單細(xì)胞測(cè)序已成為揭示稀有亞群、推斷分化路徑和連接分子特征與臨床預(yù)后的核心技術(shù)工具。
參考文獻(xiàn)：
Fu, S., Tang, M., Zhao, C. et al. MAIT cell plasticity generates CD4+ MAIT cells that promote HCC progression via metabolic crosstalk with tumor cells. Cell Mol Immunol 23, 491–504 (2026). https://doi.org/10.1038/s41423-026-01409-8