培養(yǎng)基中的微器官：

類器官模型是一種3D(三維)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其與體內(nèi)的來(lái)源組織或器官高度相似。這些3D系統(tǒng)可復(fù)制出已分化 組織的復(fù)雜空間形態(tài)，并能夠表現(xiàn)出細(xì)胞與細(xì)胞、以及細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用。理想狀態(tài)下，類器官與體內(nèi)分 化的組織具有相似的生理反應(yīng)。這不同于傳統(tǒng)的2D(二維)細(xì)胞培養(yǎng)模型，后者在物理、分子和生理學(xué)等特性上通常 與來(lái)源組織的相似性很低。

雖然最早的3D類器官模型創(chuàng)立于40年前，但是其應(yīng)用直到最近仍很有限，這是因?yàn)樵缙诘念惼鞴倌Ｐ托枰罅?起始細(xì)胞、不適于高通量篩選、而且經(jīng)常呈現(xiàn)出較低的體外活力[1]。隨著多能干、祖細(xì)胞分離技術(shù)的提高，早期類 器官模型的缺陷大部分均得以克服，這使得研究人員能夠研發(fā)出高重復(fù)性、壽命長(zhǎng)的類器官。

類器官技術(shù)的快速發(fā)展，以及對(duì)于多種體內(nèi)和體外結(jié)構(gòu)廣泛而隨意地使用類器官這個(gè)術(shù)語(yǔ)，讓Lancaster 和 Knoblich覺得有必要對(duì)類器官下一個(gè)基本的定義。他們將類器官定義為:“器官特異性細(xì)胞的集合，這些細(xì)胞從干細(xì) 胞或器官祖細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，并能以與體內(nèi)相似的方式經(jīng)細(xì)胞分序(cell sorting out) 和空間限制性的系別分化而實(shí)現(xiàn)自 我組建”。

根據(jù)Lancaster和Knoblich的定義，類器官應(yīng)該具有和器官一樣的若干重要特征:
(1)必須包含一種以上與 來(lái)源器官相同的細(xì)胞類型；
(2)應(yīng)該表現(xiàn)出來(lái)源器官所特有的一些功能；
(3)細(xì)胞的組織方式應(yīng)當(dāng)與來(lái)源器官相似[2]

這一切是怎樣開始的？

2009年，Hans Clevers和其實(shí)驗(yàn)室的博士后Toshiro Sato用來(lái)源于小鼠腸道的成體干細(xì)胞培育出首個(gè)微型腸道 (mini-guts)類器官[3]。后來(lái)，他們將這個(gè)方法擴(kuò)展到人上皮類器官的培養(yǎng)上[4]。這些類器官可能會(huì)使研究者對(duì)腸道 的健康與疾病，包括結(jié)直腸癌等產(chǎn)生新的認(rèn)知[3, 4]。

這個(gè)方法啟發(fā)了其他科學(xué)家，他們從小鼠和人的組織中培育出多種類器官。這些類器官細(xì)胞團(tuán)塊小到?jīng)]有血液 供應(yīng)仍能存活，然而又足夠大和復(fù)雜，可以告訴我們組織和整體器官的發(fā)育和生理學(xué)方面的一些信息。

類器官制備的典型方法首先要分離出胚胎或多能干細(xì)胞，然后將它們培養(yǎng)在一個(gè)支持介質(zhì)(如基質(zhì)膠Matrigel)上， 使其能夠三維生長(zhǎng)。類器官中包含多種已分化的細(xì)胞類型，這些細(xì)胞類型在體內(nèi)相應(yīng)的器官中也有存在。比如，小腸 上皮的所有細(xì)胞類型在Sato等報(bào)道的小腸類器官模型中均有體現(xiàn)[3]。介導(dǎo)類器官形成的信號(hào)通路與體內(nèi)器官發(fā)育與 穩(wěn)態(tài)維持的信號(hào)通路是相同的，因此，細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和小分子也要添加到培養(yǎng)基中，以激活或者抑制參與類器 官形成的特定信號(hào)通路。制備不同的類器官需使用不同的添加物組合，即使對(duì)于小腸和結(jié)腸等結(jié)構(gòu)非常相近的組織， 添加物的組合也不盡相同[4]。

類器官的培養(yǎng)有多種不同的方法，其中一些剛剛開始探索。下文將給出類器官培養(yǎng)的一些實(shí)例，并著重介紹細(xì) 胞因子、生長(zhǎng)因子和小分子在其中的使用。

胃腸道(GUSTROINESTINAL,GI)類器官

過(guò)去，對(duì)于胃腸道(GI)的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，完全依靠動(dòng)物模型和腫瘤細(xì)胞系，然而后者與人體生理學(xué)的相關(guān)性非常
有限，因此從人類細(xì)胞獲得GI類器官具有非常重要的意義[4, 5]。

小腸的上皮層由纖細(xì)、微小的突起，即腸絨毛(villi)組成。絨毛的基部有稱為隱窩(crypts)的龕狀結(jié)構(gòu)，這里是負(fù) 責(zé)腸粘膜持續(xù)更新的小腸干細(xì)胞的棲息地。在最初培育小鼠小腸類器官時(shí)，培養(yǎng)基中添加了EGF(表皮生長(zhǎng)因子)， R-spondin-1和Noggin等生長(zhǎng)因子[3]。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)小鼠結(jié)腸類器官時(shí)，除上述三種生長(zhǎng)因子外，還需添加Wnt-3A。 對(duì)人類小腸及結(jié)腸類器官的研究表明，除了上面所提到的4種生長(zhǎng)因子(EGF，R-spondin-1，Noggin和Wnt3A)外，還 需要加入p38 MAP激酶抑制劑(SB 202190)和TGF-β抑制劑(A-83-01)[4]。

最近的研究顯示，從人胚胎干細(xì)胞(ESCs)或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)在體外培育得到的人小腸類器官(HIO)移 植入體內(nèi)后可形成有功能的成熟小腸組織。為誘導(dǎo)形成定向內(nèi)胚層(definitive endod，erm DE)，人ESCs或iPSCs需先 用含Activin A的培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后在含Activin A，F(xiàn)GF-4和GSK3抑制劑(CHIR99021)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)形成球 狀體(spheroids)。這些球狀隨后被放置在Matrigel中，并用添加了EGF和Noggin的小腸生長(zhǎng)培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，即可產(chǎn) 生上述的HIO。最后，研究人員將HIO移植到免疫缺陷小鼠的體內(nèi)進(jìn)行觀察[6]。

腦類器官

人類大腦的高度復(fù)雜性，使得許多關(guān)于腦疾病的研究很難在生物模型中開展，所以亟需建立一個(gè)人腦發(fā)育的體外模型。

現(xiàn)有一種可生成3D腦組織，即所謂的腦類器官的方法，該方法很好地模擬了腦器官的內(nèi)源性發(fā)育過(guò)程。利用該方 法，使用患者特異性的iPSCs(誘導(dǎo)多能干細(xì)胞) 培育出頭小畸型(microcephaly) 的人3D類器官，為研究人頭小畸型的 發(fā)生機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。過(guò)去通常用小鼠模型來(lái)研究人的頭小畸形，但小鼠與人的較大差異導(dǎo)致此項(xiàng)研究的失敗。人頭 小畸型類器官的具體制備方法是將患者的皮膚成纖維細(xì)胞重編程為iPSCs，然后在添加了FGF-basic(堿性成纖維細(xì)胞 生長(zhǎng)因子)，CHIR 99021和MEK抑制劑(PD 0325901)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天。快速增長(zhǎng)的克隆被挑出，并傳代于經(jīng)滅活 處理的CF-1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)上生長(zhǎng)。隨后，將單個(gè)細(xì)胞接種在添加了低濃度的FGF-basic和高濃度的ROCK 抑制劑(Y 27632) 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成神經(jīng)上皮組織后轉(zhuǎn)移至Matrigel膠滴(droplets)中，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的靜態(tài)生長(zhǎng)， 將這些組織膠滴轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中，并加入含有維甲酸的分化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)分析這些患者的類器官， 研究人員發(fā)現(xiàn)過(guò)早的神經(jīng)元分化，這可能是導(dǎo)致疾病表型的原因[7]。

來(lái)源于iPSCs的類器官神經(jīng)培養(yǎng)技術(shù)也用于研究重癥特發(fā)性自閉癥譜系障礙(ASD)病人的神經(jīng)發(fā)育改變。 類胚體 (embryoid bodies, EBs)從經(jīng)Y 27632預(yù)處理的未分化iPSCs克隆獲得，然后用Accutase消化形成單細(xì)胞，并接種于添 加了Y 27632和重組小鼠Noggin 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以誘導(dǎo)前腦(forebrain)的形成。之后，為形成神經(jīng)花環(huán)(neural rosettes)，收集自由懸浮的EBs并鋪板于包被有Matrigel的組織培養(yǎng)皿中，加入添加了Noggin的神經(jīng)元培養(yǎng)基。第二天， 神經(jīng)元培養(yǎng)基換液，并添加FGF2，Noggin和人Dkk1。兩三天后，手動(dòng)分割神經(jīng)花環(huán)并將自由懸浮的細(xì)胞團(tuán)塊鋪板于 玻璃培養(yǎng)皿(Petri dish)中，加入含F(xiàn)GF2和EGF的神經(jīng)元培養(yǎng)基。懸浮培養(yǎng)五天后，將自由漂浮的細(xì)胞團(tuán)塊以單個(gè)團(tuán)塊 的形式鋪板于具有超低附著力(ultra-low-attachment)的96孔板中，繼續(xù)用含有FGF2和EGF的神經(jīng)元培養(yǎng)基培養(yǎng)，隨后 在含有BDNF和GDNF的培養(yǎng)基中完成終末分化[8]。

B細(xì)胞濾泡類器官

初始(Na?ve)B細(xì)胞遇到抗原時(shí)，會(huì)在淋巴結(jié)或脾臟中形成細(xì)胞聚團(tuán)，即生發(fā)中心。在生發(fā)中心中，B細(xì)胞增殖、 突變以產(chǎn)生高親和力抗體、并進(jìn)行克隆擴(kuò)增。到目前為止，使用2D(二維)細(xì)胞培養(yǎng)很難在體外重現(xiàn)這一過(guò)程。

B細(xì)胞濾泡類器官并非使用傳統(tǒng)的Matrigel 3D培養(yǎng)方法，而是用明膠(gelatin)和硅酸鹽納米顆粒(silicatenanoparticle) 混合物來(lái)模擬體內(nèi)淋巴器官的微環(huán)境。從脾臟獲得的初始B細(xì)胞與表達(dá)CD40L和B細(xì)胞活化因子(BAFF)的 轉(zhuǎn)基因基質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)在由硅酸鹽納米顆粒加固的水凝膠支架中，培養(yǎng)基中含有小鼠的IL-4。比2D培養(yǎng)快得多，只 需經(jīng)過(guò)數(shù)天的時(shí)間，這些類器官中的B細(xì)胞即可成熟并發(fā)生類別轉(zhuǎn)換(class switching)[9]。

肝臟類器官

肝的發(fā)育涉及到來(lái)自內(nèi)胚層和中胚層的組織之間復(fù)雜的相互作用。肝臟最初起源于內(nèi)胚層中前腸上皮細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的肝芽結(jié)構(gòu)，肝芽來(lái)源的肝母細(xì)胞形成肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞，而肝臟成纖維細(xì)胞和星狀細(xì)胞是由附近的中胚層來(lái) 源的間質(zhì)(mesenchyme)分化而來(lái)[10]。

最近建立了一種培育人類肝芽樣組織的方法，使用三種細(xì)胞群體的混合物，模擬了肝發(fā)育早期的三個(gè)細(xì)胞系別，即 人多能干細(xì)胞(PSC) 來(lái)源的肝細(xì)胞、人間充質(zhì)干細(xì)胞和人內(nèi)皮細(xì)胞。進(jìn)行內(nèi)胚層分化時(shí)， 將人iPSCs 接種于包被有 Matrigel的培養(yǎng)皿中，加入含Activin A的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。人iPSCs來(lái)源的內(nèi)胚層細(xì)胞隨后用含人FGF-basic和人BMP4 的培養(yǎng)基培養(yǎng)，以制備肝內(nèi)胚層細(xì)胞，即iPSC-HEs。人iPSC-HEs然后與基質(zhì)細(xì)胞(包括人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)和 人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)共培養(yǎng)。這些細(xì)胞當(dāng)以高密度與一層Matrigel混合后會(huì)自發(fā)形成三維肝芽。將這些肝芽移植入小 鼠體內(nèi)后會(huì)有血管生成，并呈現(xiàn)出肝臟所特有的功能，移植鼠在藥物誘導(dǎo)的致死性肝衰竭模型中可以存活[11]。

視網(wǎng)膜類器官

視網(wǎng)膜是眼睛中感受光線的神經(jīng)區(qū)域，它來(lái)源于神經(jīng)外胚層。眼睛是由多種細(xì)胞以三維方式組成的高度復(fù)雜的器官，視網(wǎng)膜作為眼睛的一部分，其結(jié)構(gòu)也相當(dāng)復(fù)雜。視網(wǎng)膜發(fā)育的早期階段會(huì)形成兩個(gè)相鄰的上皮細(xì)胞層，即外側(cè)的 視網(wǎng)膜色素上皮層和內(nèi)側(cè)的神經(jīng)視網(wǎng)膜層，最終生成含有光受體層和支持細(xì)胞層的組織[12]。

視杯類器官來(lái)源于人ESCs(胚胎干細(xì)胞)，從小鼠ESCs也可制備出相似的類器官。進(jìn)行視網(wǎng)膜分化時(shí)，hESCs在 含有Y 27632的視網(wǎng)膜分化培養(yǎng)基中再聚集(reaggregated)，培養(yǎng)的第2天到第18天期間加入Matrigel。為形成視杯細(xì) 胞，需要在培養(yǎng)的第15天到第18天添加CHIR 99021(或重組Wnt3A)和重組人Sonic Hedgehog(Shh)到分化培養(yǎng)基中。 這些人視網(wǎng)膜類器官和小鼠的視網(wǎng)膜有許多相似的特征，但同時(shí)也具有人視網(wǎng)膜的一些特點(diǎn)。突出的特點(diǎn)是，人類的 視網(wǎng)膜類器官較大，需要更多的時(shí)間進(jìn)行發(fā)育，并且可以長(zhǎng)成含視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的多層組織，而視錐細(xì)胞的分化 在小鼠ESCs的培養(yǎng)中非常罕見[13]。

腎臟類器官

腎臟是中斷中胚層(intermediate mesoderm，IM)通過(guò)IM來(lái)源的后腎間質(zhì)(metanephric mesenchyme，MM)和成形 的輸尿管芽(ureteric bud，UB) 相互作用分化而成。MM來(lái)源的腎祖細(xì)胞是腎單位的前體，而IM自身則源于后部原條 (posterior primitive streak)[14]。

在經(jīng)輻照的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)的人hESCs鋪板于包被有Matrigel的96孔培養(yǎng)板中，過(guò)夜培養(yǎng)后加入含 Activin A和BMP-4，或只含CHIR 99021的無(wú)血清培養(yǎng)基，然后培養(yǎng)在含有FGF-9和肝素的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)IM細(xì)胞的形成。 這些細(xì)胞隨后在含有FGF-9，BMP-7和維甲酸(前面用Activin A/BMP-4誘導(dǎo)的細(xì)胞)或者含有FGF-9和肝素(前面只用 CHIR 99021誘導(dǎo)的細(xì)胞)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。誘導(dǎo)腎臟類器官時(shí)，將人hESCs來(lái)源的腎臟細(xì)胞分離成單個(gè)細(xì)胞，離心形成 細(xì)胞沉淀，然后鋪于覆有IV型膠原蛋白的濾膜上，并使濾膜懸浮在培養(yǎng)基中。該研究在化學(xué)成分明確的培養(yǎng)條件下，利 用參與正常胚胎發(fā)育的生長(zhǎng)因子，成功地使hESC分化生成UB和MM，并最終在體外自組形成含有腎單位的3D結(jié)構(gòu)[15]。

類器官的治療潛力

未來(lái)類器官的研究將主要集中于疾病模型，如發(fā)育障礙、遺傳疾病、癌癥和退行性疾病等。使用患者的iPSCs可建 立非常有價(jià)值的疾病模型，當(dāng)動(dòng)物模型短缺時(shí)尤為重要。類器官可以實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的藥效和毒性進(jìn)行更有效地檢測(cè)，因?yàn)?類器官可直接由人類細(xì)胞生成，從而避免了因動(dòng)物和人類細(xì)胞間的差異而導(dǎo)致的檢測(cè)結(jié)果的不可靠性。類器官的藥物 測(cè)試也可能會(huì)極大地減少動(dòng)物在臨床前試驗(yàn)中的使用。在體外構(gòu)建用于移植的組織和器官是條漫漫長(zhǎng)路，希望類器官 能使其更進(jìn)一步。盡管類器官的前景廣闊，但仍有很多困難亟待解決，比如成熟度不易控制，以及缺乏血管等。

相關(guān)產(chǎn)品

1. Stoker AW, Streuli CH, Martins-Green M et al. Designer microenvironments for the analysis of cell and tissue function.Curr Opin Cell Biol1990; 2:864 –874.

2. Lancaster MA, and Knoblich JA, Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.Science ,2 014 345:1247125.

3. Sato T, Vries RG, Snippert HJ et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.Nature 200 9; 459:262–265.

4. Sato T, Stange DE, Ferrante M et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’sepithelium. Gastroenterology 2011; 141: 1762–1772.

5. Wildenberg ME, van den Brink GR. A major advance in ex vivo intestinal organ culture. Gut 2012;6 1:96 1-962.

6. Watson CL, Mahe MM, Múnera J, et al. An in vivo model of human small intestine using pluripotent stem cells. Nat. Med.2 014; 20:1310-1314.

7. Lancaster MA, Renner M, Martin C-A, et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.Nature. 2013; 501:373–379.

8.Mariani J,Coppoal G,Zhang P,et al.FOXG1-dependent dysregulation of GABA/glutamate neuron differentiation in autism spectrum disorders.Cell,2015 162:375-390.

9. Purwada A, Jaiswal MK, Ahn H, et al. Ex vivo engineered immune organoids for controlled germinal center reactions.Biomaterials,2015 63:24-34.

10. Zhao R and Duncan SA, Embryonic development of the liver.Hepatology 2005 41:956–967.

11. Takebe T, Sekine K, Enomura M, et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.Nature,2 013 499:481-484.

12. Heavner W and Pevny L. Eye Development and Retinogenesis. Cold Spring Harb. Perspect.Biol.,2012 4: a008391.

13.Nakano T,Ando S,Takata N,et al.Self-formation of optic cups and storable stratified nerual retina from human ESCs.Cell Stem Cell,2012 10:771-85.

14. Little MH and McMahon AP. Mammalian Kidney Development: Principles, Progress, and Projections.Cold Spring Harb Perspect Bio.l. , 2012 4:a008300.

15.Takasato M,Er PX,Becroft M,et al.Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.Nat. Cell Bio.,2014 16:118-26.