JACS(IF=14.4)｜復(fù)旦陸豪杰教授團隊攻克Tn抗原檢測難題：一步酶促策略如何實現(xiàn)糖基化位點的精準Mapping？

英文標題：A Versatile One-Step Enzymatic Strategy for Efficient Imaging and Mapping of Tumor-Associated Tn Antigen

中文標題：一種用于高效成像和定位腫瘤相關(guān)Tn抗原的通用一步酶促策略

發(fā)表期刊：Journal of the American Chemical Society

影響因子：14.4

研究背景

腫瘤相關(guān)碳水化合物抗原(Tumor-Associated Carbohydrate Antigens, TACAs)的異常糖基化是癌癥的重要標志，其中Tn抗原(CD175)作為黏蛋白O-聚糖前體單糖(α-GalNAc)，在結(jié)腸、乳腺、胰腺等多種癌癥中高表達，并與腫瘤侵襲性、轉(zhuǎn)移及免疫抑制密切相關(guān)，是潛在的診斷標志物及治療靶點。然而，傳統(tǒng)檢測方法（如凝集HPA、SBA、VVA及抗體）存在特異性差（凝集素可結(jié)合血型A等含末端GalNAc的聚糖）和靈敏度低（抗體需識別特定Tn-肽表位且依賴多價結(jié)合）的缺陷，而現(xiàn)有化學(xué)酶法因ST6GalNAc1的多底物特性難以單獨區(qū)分Tn抗原，亟需高效檢測技術(shù)。本研究開發(fā)的一步酶促標記策略，通過設(shè)計熒光/可切割生物素標記的UDP-Gal衍生物，利用T-合成酶底物特異性實現(xiàn)Tn抗原的高效標記與精準定位，為解決上述問題提供了創(chuàng)新方案。

研究結(jié)果

1、核心技術(shù)策略：一步酶促標記系統(tǒng)的設(shè)計

（1）探針設(shè)計與酶促標記原理

研究團隊基于尿苷-5′-二磷酸-α-D-半乳糖(UDP-Gal)衍生物，合成兩種功能性探針：帶熒光基團Cy3 的探針I(yè)I和含可切割二硫鍵生物素的探針I(yè)II。利用人T-合成酶(C1GalT1)對Tn抗原的底物特異性，通過一步酶促反應(yīng)直接將探針標記至Tn抗原，避免傳統(tǒng)兩步法中額外的CuAAC點擊化學(xué)反應(yīng)。其中，Cy3探針用于熒光成像，生物素探針結(jié)合LC-MS/MS實現(xiàn)糖蛋白富集與位點分析，探針中的硫醇可切割S-S鍵提升糖蛋白組鑒定的效率與準確性。

（2）技術(shù)流程

該策略通過“探針T-合成酶反應(yīng)體系構(gòu)建→樣本標記（細胞裂解液/活細胞/血清/組織）→熒光成像或親和素珠富集→LC-MS/MS分析”流程，實現(xiàn)Tn抗原的可視化、富集及位點特異性定位，技術(shù)框架如圖1所示。

圖1. 用于Tn抗原可視化、富集和定位的一步酶促策略概述

2、技術(shù)性能驗證與對比

（1）靈敏度與效率提升

一步法較傳統(tǒng)方法顯著優(yōu)化：5 μg Jurkat細胞裂解液經(jīng)一步法標記的信號強度超過傳統(tǒng)VVA方法檢測40 μg樣本的10倍，對牛下頜腺黏蛋白(BSM)的檢測靈敏度提升至少100倍。熒光凝膠（圖2A）顯示，一步法標記的Tn糖蛋白（如>70 kDa大分子）熒光信號強于兩步法；Western blot（圖2B）證實，一步法通過生物素探針I(yè)II標記的糖蛋白信號更強、背景更低。與VVA對比（圖2C）可見，5 μg一步法標記的BSM樣本可清晰檢測，而40 μg VVA檢測幾乎無信號，驗證了一步法在低豐度樣本中的檢測優(yōu)勢。

圖2. Tn糖蛋白一步酶促標記的效率評估

（2）多場景適用性

活細胞標記：共聚焦顯微鏡（圖3A）和流式細胞術(shù)（圖3B）顯示，一步法可通過熒光探針I(yè)I特異性標記Jurkat活細胞表面的Tn抗原，標記的糖蛋白在活細胞中以>70 kDa大分子為主，在細胞裂解液中則以< 100 kDa中小分子為主（圖3C）。

臨床樣本：在人血清和宮頸組織裂解液中，一步法通過T-合成酶催化實現(xiàn)Tn抗原的特異性標記，為臨床診斷提供潛在應(yīng)用價值。

圖3. 活Jurkat細胞上Tn抗原的一步酶促標記

3、技術(shù)應(yīng)用：Tn糖蛋白組的定位與分析

（1）糖蛋白與糖基化位點鑒定

實驗流程如圖4A所示，包括細胞裂解、酶促標記、胰蛋白酶消化、親和素珠生物素富集及LC-MS/MS分析。利用可切割生物素探針I(yè)II標記HEK293F???和 Jurkat細胞裂解液，經(jīng)上述流程后，成功鑒定出454個Tn糖蛋白和624個Tn糖基化位點，其中28個蛋白在兩細胞系中共同表達（圖4B）。

（2）糖蛋白分布特征

生物信息學(xué)分析顯示，Tn糖蛋白主要富集于細胞膜和細胞外外泌體，極少存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，符合其作為分泌型糖蛋白的生物學(xué)特性（圖4C）。糖基化位點中86%為Ser/Thr-Tn肽段，14%為Tyr-Tn肽段，且包含單個及簇狀Tn位點，表明該方法可突破傳統(tǒng)抗體對肽段表位的依賴，直接標記Tn抗原本身。

圖4. 通過LC-MS/MS對Tn糖蛋白的鑒定

4、技術(shù)價值與展望

（1）創(chuàng)新性

該研究首次開發(fā)Tn抗原的一步酶促標記策略，較傳統(tǒng)方法靈敏度提10-100倍，操作流程從兩步簡化為一步，并實現(xiàn)“可視化-富集-定位”功能整合，為糖生物學(xué)研究提供突破性工具。

（2）應(yīng)用潛力

癌癥診斷：血清和組織中Tn抗原的高效檢測可作為新型診斷標志物，補充現(xiàn)有臨床檢測體系；

機制研究：精準定位624個Tn糖基化位點，為揭示腫瘤發(fā)生中的糖基化調(diào)控機制提供數(shù)據(jù)支撐；

藥物開發(fā)：通過Tn糖蛋白組分析，可篩選潛在免疫治療靶點，推動抗體藥物研發(fā)。

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END

Peng 撰文

Winly 校稿