杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）是一種致命的神經(jīng)肌肉疾病，其臨床表現(xiàn)是由于缺乏功能性肌肉營養(yǎng)不良蛋白而引起的進(jìn)行性肌肉萎縮，病人平均壽命僅20歲左右。到目前為止，臨床上尚無完全治愈DMD的方法。 對DMD治療研究主要集中于緩解DMD病人肌肉萎縮癥狀及恢復(fù)功能性dystrophin蛋白表達(dá),其中以肌肉生長抑制因子(myostatin)為主要作用靶點(diǎn)的輔助治療研究受到廣泛關(guān)注。
肌肉生長抑制素（Myostatin）是在肌肉發(fā)育過程中充當(dāng)肌肉生長負(fù)性調(diào)控因子。抑制肌肉生長抑制素可減輕DMD小鼠的病理進(jìn)展。眾所周知,短肽在血液中極不穩(wěn)定,半衰期較短,前期研究發(fā)現(xiàn),哺乳類細(xì)胞分泌的一種納米級囊泡結(jié)構(gòu)-外泌體(exosome),可作為蛋白和核酸藥物的運(yùn)輸載體,并對核酸起到一定保護(hù)作用。
外泌體（exosomes）是一種能被機(jī)體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞分泌的天然生物納米顆粒，廣泛存在分布在體液中，攜帶和傳遞重要的信號分子，形成了種全新的細(xì)胞-細(xì)胞間信息傳遞系統(tǒng)。影響細(xì)胞的生理狀態(tài)并與多種疾病的發(fā)生與進(jìn)程密切相關(guān)。
天津醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系和免疫微環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室尹海芳教授課題組利用杜興肌肉萎縮癥小鼠模型(mdx小鼠),系統(tǒng)研究exosome作為propeptide短肽運(yùn)輸載體的可行性和應(yīng)用潛力,通過檢測負(fù)載propeptide短肽的exosome對DMD肌肉的改善作用,以期待為DMD治療提供一種新型藥物運(yùn)輸載體和治療手段。實(shí)驗(yàn)證明，通過將肌肉生長抑制素前肽的抑制結(jié)構(gòu)域融合到CD63的第二個細(xì)胞外環(huán)（EXOpro）中，將前肽錨定在外泌體表面，可以顯著提高前肽的血清穩(wěn)定性，遞送效率和功效。重復(fù)施加EXOpro可加速肌肉再生和生長，從而導(dǎo)致肌肉的質(zhì)量顯著增加且功能逐漸恢復(fù)，并且在mdx小鼠中沒有檢測到毒性。更重要的是，EXOpro加入可部分恢復(fù)mdx小鼠的骨骼結(jié)構(gòu)并促進(jìn)骨骼再生。
結(jié)果表明，外泌體錨定增加了前肽的釋放和血清穩(wěn)定性，增強(qiáng)了肌生成抑制蛋白前肽的抑制作用，從而為基于前肽的DMD干預(yù)提供了一個傳遞平臺。
實(shí)驗(yàn)部分
實(shí)驗(yàn)部分采用TissueGnostics公司TissueFAXS系統(tǒng)對免疫組化免疫熒光樣本獲取圖像，StrataQuest定量分析軟件對肌肉生長抑制素前肽陽性率進(jìn)行分析。
首先采用2.5X物鏡對明場染色的組織切片樣本進(jìn)行組織區(qū)域識別，然后采用20X物鏡對識別的組織區(qū)域進(jìn)行全景掃描成像，再將獲取的組織全景圖像導(dǎo)入組織微環(huán)境定量分析軟件中，運(yùn)用自動拆色功能，可將復(fù)染的組織樣本圖一鍵轉(zhuǎn)換為單通道圖像，再運(yùn)用TG**的組織原位單細(xì)胞識別及定量分析技術(shù)，最終獲得DAB染色陽性率數(shù)據(jù)。
圖1 血清和組織中EXOpro與M-MSTN結(jié)合效率檢測
在用EXOpro處理的小鼠的四頭肌中，從2h到24h存在大量特異性染色的前肽，并在注射后1周仍可檢出（圖1H和1I）。
圖2 CTX損傷的C57BL / 6小鼠中EXOpro和前肽研究
（B）EXOpro，EXO，前肽處理的小鼠和對照組的四頭肌中前肽的免疫組化樣本。箭頭指向前肽染色陽性部分。（C）利用HE染色檢測損傷組織形態(tài)及肌纖維面積、IHC檢測胚胎肌球重鏈(e My HC)表達(dá)以評估修復(fù)效果。