來源于人多能干細胞（hiPSC）的人腦類器官與原代組織具有顯著的結構和分子相似性，已成為體外研究的良好模型。不過，由于腦類器官體積大、光學致密、發育周期長、無菌條件難以維持等特性，傳統的成像技術往往無法滿足對其發育復雜過程長期、動態的觀察需求。這對理解早期腦類器官的形態動力學，以及細胞外微環境在人腦發育早期階段中的作用帶來了嚴重挑戰。

2025年6月18日，瑞士蘇黎世聯邦理工學院團隊在頂刊Nature發表論文“Morphodynamics of human early brain organoid development”，首次系統性建立了人腦類器官形成的多尺度形態動力學視角，突破了類器官長期活體動態成像的技術瓶頸。研究團隊首先優化了多重熒光標記的腦類器官培養方案，隨后通過配套的光片顯微系統及算法成功對類器官發育兩周內的組織形態動力學、細胞行為及其與細胞外基質(ECM) 的相互作用進行了深入研究。

結果發現，外源性ECM（如基質膠）的添加可促進類器官的形態發生、細胞極化、區域化和功能成熟，顯著改善類器官的發育過程，驅動類器官向前腦及端腦分化。該調控過程依賴于對YAP1活性及WNT信號通路的抑制?？傊疚臑槲磥砟X類器官的優化以及腦部疾病的探索提供了重要指引。

研究團隊首先構建了一組具有遺傳熒光標記的hiPSC，每種細胞系表達一種內源性標記蛋白，以示蹤質膜、肌動蛋白細胞骨架、微管、細胞核及核膜。五種標記系與未標記的親本以2:100（標記:1、未標記）的比例組合并培養為腦類器官，以方便后續更清晰地分辨和追蹤單個細胞或細胞核，從而在三維空間中同時觀察多個亞細胞結構（如細胞膜、細胞骨架等）的變化動態。

接下來，研究團隊調整了腦類器官培養方案，減少了使用的iPSC細胞數量以限制類器官的初始尺寸；并在第4天即將類器官轉移到神經誘導培養基中，以將分化時間提前。這種較小的初始尺寸和早期誘導的結合，使得類器官在發育過程中能夠更早地形成擴張的腔室和神經上皮結構，從而更好地模擬人類大腦發育的早期階段。

從培養第4天開始，研究人員通過光片顯微鏡對新獲得的內源標記的腦類器官進行了188小時的連續成像，時間分辨率為30分鐘，觀察到類器官從球形胚狀體逐漸轉變為具有擴張腔室的神經上皮結構的過程。

在另一組針對16個類器官的24小時成像實驗中，觀察結果共揭示了類器官發育的三個階段，即早期快速組織和腔室生長階段、組織穩定階段（腔室融合事件）以及神經上皮成熟階段。

以上對腦類器官發育的準確捕捉證明，新型類器官培養方案和長期成像技術的結合可用于探索器官發育的多個階段，方便了對神經上皮形成和大腦區域化的深入研究。

圖：熒光標記腦類器官的長期活體成像

腦類器官中腔室的形成模擬了人類胚胎中神經管的管腔，是神經上皮細胞極性正確建立的標志，有助于神經祖細胞有序排列，對大腦皮層的分層結構模擬非常關鍵。因此，腔室的形態、數量和組織性常被用作評估腦類器官發育成熟度的指標之一。適度的腔室數量和良好的極性結構通常意味著更穩定的譜系分化和更高的可重復性。

本研究發現，添加基質膠的類器官體積更大，形成的腔室更長、更不規則，且在第5天即達到了腔室數量的峰值。相比之下，未添加外源性基質的類器官則形成更多的腔室，但體積較小，且腔室數量直到第7.8天才達到峰值。

進一步的實驗表明，ECM的組成和機械特性對腔室形態動力學有顯著影響。實驗中，類器官在含有層粘連蛋白（Laminin-111）的PEG基質中表現出更大的腔室體積和更長的腔室主軸，與基質膠條件下的類器官相似。而含有膠原蛋白肽（GFOGER）的PEG基質則導致腔室數量減少。

以上結果證實，外源添加的基質膠在腦類器官中誘導了腔室形成、擴張和融合，對人腦類器官的組織規模形態發生具有促進意義。

圖：外源性ECM影響腦類器官的形態發生

接下來，研究人員開發了一套基于空間嵌入的實例分割算法，對腦類器官中五種不同的熒光標記進行了單細胞水平的形態分析。

結果發現，隨著腦類器官的發育，細胞形態從圓形逐漸轉變為長形，核的體積也隨之減小。時間序列分析顯示，細胞形態的變化具有明顯的時空動態，如細胞的主軸長度隨時間增加，而核的體積則逐漸減小。這些變化在添加基質膠的條件下更為顯著。

此外，基質膠的添加還誘導了更高的細胞極化程度，并降低了細胞形態的異質性，這可能歸因于ECM在類器官外周區域蛋白豐度的提升和穩定基底膜的形成?？偠灾?，以上特性有助于均質的神經外胚層和神經上皮的形成，從而提供了更接近真實大腦結構和功能的類器官模型。

圖：熒光標記的細胞和細胞核形態變化

類器官的區域化指在類器官發育過程中，不同的細胞群體逐漸分化并形成具有特定功能和身份的區域，是其模擬真實大腦發育的重要特征之一。研究團隊利用多重免疫組化技術（4i）對類器官進行了多輪蛋白質標記和成像，結果發現，基質膠的添加顯著影響了類器官的區域化。

具體而言，第15天，添加基質膠的類器官主要形成前腦祖細胞，顯示出被前腦祖細胞包圍的大腔室。而未添加外源性基質的類器官則形成更多的非前腦祖細胞和神經嵴細胞。到第21天，基質膠類器官外圍主要由端腦組成，而對照組則由見腦細胞和神經嵴細胞組成。scRNA-seq分析同樣證明，基質膠可調控類器官的不同分化路徑和功能。

圖：多重免疫組化技術（4i）揭示了類器官發育過程中空間區域的出現。

對發育第13天類器官的單細胞轉錄組分析揭示，WNT-β-catenin 信號通路在無基質膠的類器官中高度上調（相關上調基因包括WLS、RSPO3和GPC3等）。此前，WLS已被確定為人腦類器官中非端腦命運的最早標志之一。研究團隊還觀察到，在無基質膠條件下上調的WLS以及其他WNT相關基因在人類原代發育腦的非端腦細胞中高度表達。因此，研究團隊假設基質膠通過調節WNT信號通路來調節腦類器官的背腹向和喙尾向模式。

近來已經有報道稱，YAP1作為一種參與感知組織機械特性的機械傳感器，可以上調心肌細胞中包括WLS在內的WNT通路基因，并介導WNT和Hippo信號通路間的串擾。本文中，發育兩周后，研究人員在無基質膠的類器官中觀察到了更高的WLS水平，YAP1表達也有同步上調。研究團隊隨后通過CUT&Tag在早期發育的腦類器官中定位了YAP1與基因組的結合，觀察到無基質膠類器官中，YAP1作為WNT信號通路的關鍵調節因子，通過上調WLS（WNT配體分泌介質）的表達，促進了類器官的尾部化，形成更多的非前腦區域。與此一致的是，用 YAP1 激活劑處理的基質膠中生長的類器官表現出無法擴張和維持腔室，導致類器官形態發生改變。

圖：YAP1 機械轉導介導的 WLS 激活

本研究通過開發長期活體成像技術和多熒光標記策略，為類器官發育的動態研究提供了新的工具。并且使用新建立的平臺，揭示了ECM在類器官形態發生和區域化中的關鍵作用，證明可以通過調節ECM的組成和機械特性，更精確地控制類器官的發育方向，使其更接近真實的人類大腦組織。這對于研究神經發育疾病、藥物篩選和細胞治療等領域具有重要的應用價值。