胃癌(GC)是一種特點(diǎn)為腫瘤細(xì)胞和腫瘤免疫微環(huán)境(TIME)高度異質(zhì)性的主要腫瘤類型。
胃印戒細(xì)胞癌（GSRCC）是胃癌的一種相對(duì)少見的病理亞型，占所有胃癌的10%以下，惡性程度極高、預(yù)后差。研究表明，早期GSRCC患者的5年生存率高于非GSRCC患者。由于缺乏特殊的臨床表現(xiàn)，超過90%的GSRCC患者診斷時(shí)就為晚期；因此，準(zhǔn)確和早期的疾病分期對(duì)GSRCC患者的治療計(jì)劃和預(yù)后至關(guān)重要。
2023年3月13日，浙江大學(xué)陳健，汪洌及德克薩斯大學(xué)MD安德森癌癥中心Liang Han共同通訊在Gastroenterology（IF=34）在線發(fā)表題為“Single-cell Profiling of Tumor
Immune Microenvironment Reveals Immune Irresponsiveness in Gastric Signet-ring
Cell Carcinoma”的研究論文。
研究提供了晚期GC患者免疫細(xì)胞組成和細(xì)胞狀態(tài)的全面分子畫像，強(qiáng)調(diào)了GSRCC的適應(yīng)性免疫無反應(yīng)性和CXCL13在腫瘤免疫微環(huán)境上的中介作用。該文章針對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)分析提供了一種強(qiáng)大的腫瘤免疫微環(huán)境導(dǎo)向的轉(zhuǎn)化研究方法。
我們招募了32例不同亞型的晚期GC患者，并使用免疫靶向單細(xì)胞圖譜分析了他們的腫瘤免疫微環(huán)境，包括(I)免疫靶向單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq，n=20名患者)和(Ii) 通過靶向抗體組合進(jìn)行蛋白表達(dá)分析。
研究發(fā)現(xiàn)，與非GSRCC相比，GSRCC的腫瘤免疫微環(huán)境似乎處于靜止?fàn)顟B(tài)，CD4+和CD8+T細(xì)胞都難以動(dòng)員，這進(jìn)一步損害了B細(xì)胞的正常功能。CXCL13主要由Tfh、Th17和耗竭的CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生，是這種轉(zhuǎn)化的中心協(xié)調(diào)者。該研究表明CXCL13的表達(dá)可以預(yù)測(cè)GC患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷的反應(yīng)，這可能與其對(duì)三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）的影響有關(guān)。
本文研究強(qiáng)調(diào)了產(chǎn)生CXCL13的耗盡的CD8+T細(xì)胞在促進(jìn)抗腫瘤反應(yīng)中的重要性。對(duì)于非GSRCC患者，采取常規(guī)治療包括化療和免疫關(guān)卡阻斷可能是可行的；而對(duì)于GSRCC患者，提高耗盡的CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生CXCL13的能力可能是扭轉(zhuǎn)難治性疾病的關(guān)鍵。
實(shí)驗(yàn)部分
為了獲取更為全面的免疫細(xì)胞亞群及其細(xì)胞狀態(tài)的信息，研究者通過TissueFAXS Cytometry技術(shù)，從一張組織切片樣本的全景尺寸上，使用高倍物鏡同時(shí)獲取到了9種蛋白標(biāo)記的成像結(jié)果。這種單細(xì)胞尺度上的光學(xué)原始數(shù)據(jù)，結(jié)合連續(xù)全光譜成像及光譜拆分技術(shù)，保證每個(gè)標(biāo)記物信號(hào)的純凈和準(zhǔn)確，為后續(xù)分析提供了可靠的基礎(chǔ)。
TLS為細(xì)胞通信以及啟動(dòng)和維持T和B細(xì)胞反應(yīng)提供了局部和關(guān)鍵的微環(huán)境，導(dǎo)致了放大的抗腫瘤免疫反應(yīng)和有利的結(jié)果。CXCL13被認(rèn)為是TLS的典型標(biāo)記物，并參與了整個(gè)TLS組織。TLS的存在被認(rèn)為是CXCL13+CD4+和CXCL13+CD8+T細(xì)胞獲得臨床益處所不可或缺的。因此，CXCL13可能通過干擾GSRCC中TLS的形成而誘導(dǎo)時(shí)間異質(zhì)性。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們分析了另一組GC患者的HE染色切片，確實(shí)觀察到GSRCC中TLS的頻率低于非GSRCC組織中的TLS(Fig
2 G )。
然后，對(duì)腫瘤組織切片進(jìn)行多重免疫組織化學(xué)(MIHC)染色，以揭示CXCL13的空間關(guān)系。
實(shí)驗(yàn)采用了mIHC方法，最多可有9個(gè)特異標(biāo)記，并對(duì)具有代表性的GSRCC和非GSRCC樣本進(jìn)行了核染色。事實(shí)上，我們?cè)?span lang="EN-US">GSRCC中幾乎看不到TLS，但在非GSRCC中普遍存在組織良好的TLS(Fig 1 G，H)。在TLS內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量的CXCL13+CD4+和CXCL13+CD8+T細(xì)胞。由于PD-1的表達(dá)普遍較低，在CD8+T細(xì)胞上可檢測(cè)到PD-1和CXCL13的共表達(dá)，表明CD8-Tex細(xì)胞表達(dá)CXCL13的能力較弱。
Fig 1 多重免疫組織化學(xué)(MIHC)采用酪胺信號(hào)放大(TSA)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法和多光譜成像。(G)GSRCC和(H)非GSRCC具有代表性的GC切片分別用E-鈣粘蛋白(青色)、CD4(綠色)、CD19(黃色)、CD8(橙色)、Madcam(紅色)、DC-LAMP(洋紅色)、PD-1(白色)、Epcam(橄欖)、CXCL13(栗色)和細(xì)胞核(藍(lán)色)染色。
Fig 2 GSRCC和非GSRCC之間蛋白表達(dá)的差異
G：非GSRCC和GSRCC HE樣本中TLS頻率。
H：多重免疫組織化學(xué)(mIHC)采用酪胺信號(hào)放大(TSA)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法和多光譜成像。GSRCC(左)和非GSRCC(中)具有代表性的GC切片分別用CD8(洋紅)、CXCL13(橙色)、CD19(綠色)和細(xì)胞核(藍(lán)色)染色。及T細(xì)胞-B細(xì)胞聚集的程度(右)。
Tissue
Cytometry技術(shù)在胃癌研究中的優(yōu)勢(shì)：
1 對(duì)胃癌組織切片進(jìn)行自動(dòng)全景成像和無痕拼接，獲得高清晰度和高分辨率的數(shù)字化圖像，方便觀察和存儲(chǔ)。
2對(duì)胃癌組織中的單個(gè)細(xì)胞（包括細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞膜等）進(jìn)行鑒定和定量分析，利用多種標(biāo)記物（如蛋白、核酸等）和多種參數(shù)（如染色強(qiáng)度、形態(tài)學(xué)、空間分布等）挖掘樣本差異性。
3 對(duì)胃癌組織中的腫瘤微環(huán)境進(jìn)行研究，包括腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)、腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤干細(xì)胞、腫瘤免疫等方面，揭示腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、變化和轉(zhuǎn)歸機(jī)制。
4 利用類流式數(shù)據(jù)呈現(xiàn)和分析技術(shù)，通過散點(diǎn)圖、直方圖和熱力圖等方式展示細(xì)胞量化結(jié)果，通過設(shè)門圈選和正反向回溯功能進(jìn)行細(xì)胞群分類或再分析，實(shí)現(xiàn)影像與分析結(jié)果的緊密結(jié)合。
5 根據(jù)樣本和分析需求進(jìn)行定制化APP制作，實(shí)現(xiàn)樣本全自動(dòng)分析和數(shù)據(jù)輸出，提高工作效率和準(zhǔn)確性，同時(shí)支持多種硬件升級(jí)方案，滿足不同的研究需求。
這些優(yōu)勢(shì)使得全景組織細(xì)胞定量分析系統(tǒng)成為胃癌研究中的一種強(qiáng)有力的工具，為胃癌的診斷、治療和預(yù)防提供了有價(jià)值的數(shù)據(jù)支持。