期刊：Advanced science
影響因子：14.1
通訊單位：中國科學技術大學
通訊作者：胡源，馬小鵬，楊振業，余發智
伯豪技術服務+產品：單細胞RNA測序、伯優®組織樣本懸液制備試劑盒
導語
癌癥治療中，黑磷（BP）展現出作為藥物載體和光熱劑的潛力，但在癌癥治療中的功能仍有待深入探索。本研究探討了聚乙二醇功能化黑磷（BP-PEG）納米片在乳腺癌模型中的免疫調節作用。作者使用包括 4T1 荷瘤BALB/c 小鼠和 MMTV-PyMT 轉基因小鼠在內的免疫活性小鼠模型。研究發現 BP-PEG 能顯著抑制腫瘤生長和轉移，且不直接誘導腫瘤細胞毒性。質譜流式分析表明，BP-PEG 通過募集中性粒細胞重塑腫瘤免疫微環境。中性粒細胞耗竭實驗進一步證實，BP-PEG 的抗腫瘤效應依賴于中性粒細胞。常規RNA測序和單細胞 RNA 測序結果顯示，BP-PEG 主要被巨噬細胞攝取，進而誘導 IL1A 和 CXCL2 等炎癥因子釋放，這些因子會增強中性粒細胞的募集和激活，從而放大抗腫瘤免疫應答。最后，共培養實驗證實，BP-PEG 確實能增強中性粒細胞和自然殺傷（NK）細胞的抗腫瘤活性。這些發現表明，BP-PEG 是一種能夠重編程腫瘤微環境、以增強抗乳腺癌先天免疫的免疫調節制劑。通過激活中性粒細胞介導的抗腫瘤活性，BP-PEG 提供了一種獨特的治療策略，有望提升現有癌癥免疫治療的療效。
主要技術
單細胞RNA測序、伯優®組織樣本懸液制備試劑盒
（技術服務+產品由伯豪生物提供）
研究結果
1. BP-PEG 合成表征及抗腫瘤抗轉移活性驗證
為提升黑磷（BP）的穩定性，本研究通過超聲剝離BP晶體并與聚乙二醇（PEG）偶聯，成功合成了聚乙二醇修飾的黑磷（BP-PEG）納米片。透射電鏡和掃描電鏡（SEM）結果顯示，BP和BP-PEG均呈現典型的二維片狀結構，BP-PEG納米片尺寸多集中在100 nm左右，小于200 nm，有利于體內穩定性和組織靶向性；zeta電位從BP的-27.6 mV變為BP-PEG的-18.1 mV，證實PEG修飾成功，顯著提升了材料的膠體穩定性；能量色散X射線光譜（EDS）、紅外光譜（FTIR）、X射線衍射（XRD）和拉曼光譜等進一步驗證了BP-PEG的化學組成和結構特征，原子力顯微鏡（AFM）顯示其厚度為10-20 nm，較未修飾BP納米片略有增加。在免疫活性乳腺癌小鼠模型的抗腫瘤活性評估中，將4T1乳腺癌細胞接種到BALB/c小鼠乳腺脂肪墊構建同源腫瘤模型，當腫瘤體積達到約100 mm³時靜脈注射BP-PEG。結果顯示，與對照組相比，BP-PEG處理組的腫瘤生長顯著受到抑制，腫瘤明顯降低，主要器官組織學分析未發現明顯毒性。對照實驗表明，單獨使用PEG對腫瘤生長無顯著影響，相同濃度下BP單獨處理與BP-PEG的抗腫瘤效果相當，而5 mg/kg劑量的BP-PEG效果弱于10 mg/kg，因此確定10 mg/kg為后續實驗的適宜劑量。在更貼近人類乳腺癌進展的MMTV-PyMT轉基因小鼠模型中，BP-PEG同樣表現出顯著的腫瘤生長抑制作用，證實其在模擬人類乳腺癌的模型中具有穩定的抗腫瘤和抗轉移作用。
圖1 BP-PEG納米片的表征及其在小鼠乳腺癌模型中的抗腫瘤活性
2. BP-PEG 無直接細胞毒性且依賴免疫系統起效
為探究BP-PEG的抗腫瘤機制，作者首先通過熒光標記和流式細胞術對比了腫瘤細胞在體內外對BP-PEG的攝取情況，發現體內腫瘤細胞攝取的BP-PEG量相當于體外4T1細胞在5 μg/mL濃度下的攝取水平。但細胞活力實驗表明，該濃度及更高濃度（最高達100 μg/mL）的BP-PEG在72小時內均未對4T1細胞增殖和存活產生顯著影響，說明BP-PEG在生理相關濃度下無直接腫瘤細胞毒性。為驗證免疫系統在BP-PEG抗腫瘤過程中的作用，本研究使用免疫缺陷NOD scid gamma（NSG）小鼠構建4T1腫瘤模型，結果顯示BP-PEG在該模型中無法抑制腫瘤生長和轉移，表明其抗腫瘤活性依賴完整的免疫系統。將人類MDA-MB-231乳腺癌細胞與乳腺癌患者PBMC共培養，發現單獨使用BP-PEG或PBMC僅能導致少量腫瘤細胞死亡，而兩者聯合使用時，超過90%的腫瘤細胞被清除，且PBMC的細胞組成與腫瘤微環境中的免疫細胞分布相似，這一結果進一步證實BP-PEG通過調控免疫微環境發揮抗腫瘤作用。
圖2 BP-PEG依賴完整的免疫系統發揮抗腫瘤特性
3. RNA 測序揭示免疫相關通路特異性激活
BALB/c小鼠和NSG小鼠腫瘤組織做bulk RNA測序，結果顯示，BP-PEG處理后，兩種小鼠模型的腫瘤基因表達譜均發生改變，但NSG小鼠與BALB/c小鼠的DEGs僅重疊17個，而BALB/c小鼠中存在234個特異性差異表達基因。通路富集分析表明，這些特異性DEGs顯著富集于免疫相關通路，其中細胞因子-細胞因子受體相互作用通路上調最為明顯，與BP-PEG依賴免疫系統發揮作用的結論一致。qPCR驗證顯示，BP-PEG處理后，IL1A、CXCL2、CCR2等參與腫瘤免疫微環境重塑的基因表達顯著上調，這些基因可能通過調控細胞因子分泌和免疫細胞招募，推動腫瘤免疫微環境從免疫抑制向免疫激活轉變。
圖3 BP-PEG在免疫活性小鼠中特異性激活免疫調控通路
4. 中性粒細胞募集增加并激活效應免疫細胞
為深入解析BP-PEG對腫瘤免疫微環境中免疫細胞群體的影響，作者使用CyTOF對BALB/c小鼠腫瘤組織中的免疫細胞做了全面分析。t-SNE聚類識別出26個不同的細胞亞群，包括中性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、B細胞、CD8?T細胞、CD4?T細胞、調節性T細胞（Tregs）和NK細胞等。BP-PEG處理組中性粒細胞亞群（C18）的數量和比例顯著增加，占CD45?免疫細胞的比例超過20%，成為優勢細胞群體；同時，免疫抑制性細胞（Tregs和M2型巨噬細胞）的比例降低，而CD8?T細胞和NK細胞中細胞毒性標志物GZMB的表達強度顯著上調，表明其抗腫瘤活性增強。免疫組化染色進一步證實，BP-PEG處理后腫瘤組織中Ly6G?中性粒細胞數量顯著增加，且GZMB?陽性細胞比例上升，驗證了CyTOF的分析結果，說明BP-PEG通過募集中性粒細胞并激活效應免疫細胞的抗腫瘤功能發揮作用。
圖4 BP-PEG增強中性粒細胞募集并激活抗腫瘤免疫細胞
5.中性粒細胞核心作用及腫瘤殺傷能力協同增強機制
中性粒細胞耗竭實驗進一步證實了其在BP-PEG抗腫瘤中的核心作用。在4T1荷瘤 BALB/c小鼠中，從腫瘤接種后第3天開始每日腹腔注射抗Ly6G抗體以耗竭中性粒細胞，結果顯示，單獨使用抗Ly6G抗體對腫瘤生長無明顯影響，但BP-PEG與抗Ly6G抗體聯合使用時，BP-PEG的腫瘤生長抑制作用被顯著逆轉，腫瘤重量明顯增加。免疫組化和流式細胞術驗證顯示，抗Ly6G抗體處理后腫瘤組織中Ly6G?中性粒細胞幾乎完全消失，同時GZMB?陽性細胞比例顯著降低，表明中性粒細胞耗竭導致抗腫瘤免疫應答減弱。單細胞RNA測序和細胞間相互作用分析發現，BP-PEG主要被巨噬細胞吞噬，巨噬細胞攝取BP-PEG后激活炎癥信號通路，促使中性粒細胞遷移、脫顆粒調控、先天免疫應答和炎癥反應相關基因的表達上調，分泌CXCL2等趨化因子；通過CXCL-CCR信號通路（尤其是CXCL2-CXCR2通路）招募中性粒細胞到腫瘤部位。使用CXCR2抑制劑SB225002處理后，BP-PEG的抗腫瘤效果幾乎完全被阻斷，證實CXCL2-CXCR2信號通路是BP-PEG介導中性粒細胞募集的關鍵途徑。此外，細胞間相互作用分析顯示，BP-PEG處理后中性粒細胞與NK細胞的相互作用數量和強度顯著高于與CD8?T細胞的相互作用，免疫熒光顯示兩者在腫瘤組織中空間定位密切；通路富集分析表明，BP-PEG上調了中性粒細胞中先天免疫應答、脫顆粒、氧化應激等抗腫瘤相關通路，增加了具有抗腫瘤表型的T1和T2型中性粒細胞比例，同時增強了NK細胞中顆粒酶介導的程序性細胞死亡通路。共培養實驗證實，從BP-PEG處理組腫瘤中分離的中性粒細胞和NK細胞，對GFP標記的4T1細胞的殺傷能力顯著高于生理鹽水組，而NK細胞耗竭會部分逆轉BP-PEG的抗腫瘤效果，表明BP-PEG通過增強中性粒細胞和NK細胞的殺瘤能力，協同發揮抗腫瘤作用。
圖5 中性粒細胞對BP-PEG的抗腫瘤作用至
參考文獻：
1. Wang J, Yu W, Shen H, et al (2025) Therapeutic Black Phosphorus Nanosheets Elicit Neutrophil Response for Enhanced Tumor Suppression. Adv Sci (Weinh) 12:e2414779. https://doi.org/10.1002/advs.202414779
本產品適用于多種組織樣本的單細胞懸液制備。組織樣本預處理后利用酶溫和、快速、有效地破壞細胞外基質，釋放細胞，經過篩、離心等標準化操作流程，生成高質量的單細胞懸液。實驗操作簡單便捷，不需要特別的解離儀器，可輕松實現多種組織的解離。制備的單細胞懸液可用于單細胞測序、細胞培養或其他細胞相關檢測。
本產品適用于胃、腎、肺、心臟、肝、腸、甲狀腺、胸腺、食管、鼻組織、皮膚、黏膜、胚胎、淋巴、睪丸、乳腺、卵巢、腫瘤組織等樣本（軟骨、硬骨、脂肪、胰腺、腦組織除外）。