Food Chem X. (IF=8.2)｜云南農大高曉余/田洋教授團隊優化草果黃酮提取技術，解鎖草果藥用潛力！

英文標題：Preparation of flavonoids from Amomum tsaoko and evaluation of their antioxidant and α-glucosidase inhibitory activities

中文標題：草果(Amomum tsaoko)黃酮類化合物的制備及其抗氧化與α-葡萄糖苷酶抑制活性的評估

發表期刊：Food Chemistry: X

影響因子：8.2

合作單位：云南農業大學

合作產品：PRM精準植物廣靶
 

研究背景

草果(Amomum tsaoko, AT)是姜科草果屬的多年生常綠叢生草本植物，主要分布于中國云南、廣西和貴州等地。作為傳統中藥和“五香”之一的香料，AT具有溫中散寒、健胃消食、調節呼吸等藥理作用，但其產業因加工鏈條短、深度開發不足，長期以低附加值香料形式利用，藥用價值研究滯后。近年來，AT化學成分研究取得進展，科學家已從中分離出300余種化合物，其中黃酮類成分占比突出，兼具抗氧化（清除自由基）與α-葡萄糖苷酶抑制活性，對糖尿病預防具有潛力。然而，傳統提取方法（如浸提、煎煮）難以高效分離黃酮類成分，而超聲波輔助提取(Ultrasonic-assisted extraction, UAE)雖利用空化效應破壞細胞壁、提升溶解性，但可能因雜質沉淀影響效率，亟需優化提取條件。大孔樹脂(Macroporous resins, MRs)作為工業上低成本、環保的純化手段，已被用于多種活性成分（如植物黃酮）的分離，但AT黃酮與UAE結合MRs的研究仍屬空白。本研究創新性提出“UAE-MRs聯合法”，旨在優化AT總黃酮制備工藝，通過不同乙醇濃度洗脫獲得高活性成分，并結合靶向代謝組學解析其化學組成，為AT資源的深度開發與藥用價值驗證奠定基礎。

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研究結果

1、草果黃酮(ATF)提取條件的優化

1.1 單因素實驗

在ATF提取優化中，隨著浸泡時間增加，12小時后黃酮含量穩定，確定為最佳參數（圖1A）；乙醇濃度與固液比：60%乙醇濃度（2.91%產量）與1:35(w/v)固液比（3.11%產量）為最優組合，可平衡溶解效率與溶劑極性（圖1B-C）。此外，超聲功率、時間及溫度對黃酮產量有顯著影響（圖1D-F）。ATF提取的優化條件為60%乙醇、1:35固液比、180W超聲功率、50分鐘超聲時間、65℃超聲溫度，為后續工藝開發提供數據支持。

圖1. 單因素對AT中黃酮產率的影響

1.2 響應面優化實驗

基于表S2的數據建立了多元二次回歸模型，用于構建提取工藝參數的回歸模型。該模型具有高度顯著性和良好擬合性，且預測值與實際值之間存在強相關性，模型適用于分析。如圖2所示，兩變量間的交互作用對黃酮產量有顯著影響；同時，各因素對黃酮產量的影響順序為：A（固液比與超聲功率）>D（超聲功率與超聲時間）>B（固液比與超聲時間）>C（固液比與超聲溫度）。

圖2. 3D響應面圖說明了各種參數對類黃酮產量的影響

1.3 模型驗證

基于響應面結果，推導并驗證了最佳工藝條件：料液比1:39（w/v）、超聲功率160W、超聲時間47分鐘、超聲溫度69℃。相較類似的提取優化研究，此方案顯著節約了乙醇用量，降低了能耗，將提取效率提升至3.33%，驗證了所用條件對提升黃酮含量的有效性。

2、大孔樹脂分離與純化草果黃酮

2.1 MR的選擇

基于10種所選樹脂材料的性能（圖3），其中，HPD300具有最小的平均孔徑和最大的比表面積（表S1），吸附與脫附能力最優；市場價與X-5、HPD100、HP-20相近，處于中等水平；工業應用廣泛，使用壽命長，經2-3次再生仍可維持良好吸附效果，展現出最強的吸附/脫附綜合能力及實際大規模應用潛力，因此被選為ATF分離與純化的候選材料。

圖3. 比較了10種MR的吸附和解吸性能

表1. Box-Behnken響應面設計中使用的因素和水平

2.2 吸附動力學

對吸附性能較強的四種大孔樹脂（X-5、HPD100、HPD300和HP-20）進行了吸附動力學研究。結果如下：①所有樹脂的吸附量均隨吸附時間增加而上升，但達到平衡時，HPD300的吸附速率最高，其次為X-5、HPD100和HP-20；②偽二級動力學模型更適用于描述X-5、HPD100、HPD300和HP-20對ATF的吸附過程，其中HPD300對ATF的吸附屬于多層吸附過程（表2）；③HPD300的內擴散速率常數（k?=1.4131）最高，表明ATF在該樹脂中擴散更迅速，吸附速率更快、更高效，體現了HPD300的吸附優勢。綜上，HPD300是ATF吸附的最佳樹脂。

表2. 動力學模型的方程和參數

2.3 吸附等溫線和熱力學

當吸附溫度升高(25℃→35℃→45℃)時，HPD300樹脂對ATF的吸附容量逐步降低，表明高溫不利于其吸附過程（圖4A）?；贚angmuir、Freundlich模型（圖4B-C）以及模型詳細數據（表3），表明Freundlich模型更適于解釋HPD300對ATF的吸附機制。此外，25℃、35℃和45℃下的1/n值均處于0.1-0.5范圍內，表明HPD300對ATF的吸附在該溫度區間內為自發過程。但溫度從25℃升至45℃時，1/n值隨之升高，說明吸附過程逐漸“硬化”?？傮w而言，25℃的吸附溫度更適于HPD300對ATF的純化。

表3. 吸附等溫線模型擬合出不同溫度下的回歸方程和吸附參數

圖4. (A)在25℃、35℃和45℃溫度下，HPD 300上ATF純化的吸附等溫曲線(B)Langmuir模型和(C)Freundlich模型

2.4 HPD300制備ATF工藝條件的優化

隨著ATF濃度升高，HPD300的吸附容量逐漸增加，但吸附速率卻呈下降趨勢，當濃度為2.79 mg/mL，此時吸附容量達平衡且吸附速率穩定（圖5A）。此外，樣品pH值也顯著影響HPD300的性能，在pH 2.0條件下，HPD300樹脂表現出最佳吸附性能（圖5B）。

樹脂-液比(resin-liquid ratio)對純化效果亦有重要影響，基于圖5C綜合分析，作者確定最優樹脂-液比為1:20。

洗脫條件對ATF純化效果同樣關鍵。由于黃酮類化合物的化學性質差異，分別采用0%至100%乙醇溶液(v/v)進行梯度洗脫，每種濃度洗脫至無色（圖5D）。結果表明：最佳洗脫流速為1.5 BV/h，對應各乙醇濃度的洗脫體積分別為2.3 BV、6.7 BV、16.7 BV、14.3 BV、8.5 BV和3.3 BV。

總的來看，相比前人研究，本方案將ATF含量從21.71%顯著提升至90%以上，驗證了HPD300樹脂對ATF分離純化的高效性。

圖5. HPD 300吸附/脫附凈化ATF的條件優化

3、抗氧化和降血糖活性

在抗氧化方面，自由基清除能力和鐵離子還原能力均隨黃酮類化合物濃度的增加呈正相關（圖6A-D），其中，抗氧化能力：30%乙醇洗脫混合物>維生素C(Vc)>20%乙醇洗脫混合物 > 粗提物（ATF粗提物，ATEE）和50%乙醇洗脫混合物表現出較弱的抗氧化能力；各洗脫組分的抗氧化能力排序為：30%>20%>40%>10%>50%>ATEE（表4），其中，20%和30%洗脫組分的抗氧化能力顯著強于其他組分。

在α-葡萄糖苷酶活性方面，30%乙醇混合物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率表現出最強的抑制效果（圖6E）?；诟飨疵摻M分的IC50值（表4），30%乙醇混合物的抑制活性最強，其次為20%、40%、10%乙醇混合物，最后是ATEE。這些結果與各乙醇洗脫組分中黃酮類化合物的含量（圖6A-D）及抗氧化活性測定結果一致，表明20%和30%乙醇可能是HPD300樹脂純化ATF黃酮類化合物的最佳洗脫劑量。

因此，20%和30%乙醇洗脫組分可作為未來ATF相關研究的重點對象。

圖6. 不同乙醇洗脫液和純化前ATEE的自由基清除活性和α-糖苷酶抑制活性

表4. DPPH、ABTS、羥基自由基和α-葡萄糖苷酶的IC50值

4、純化ATF的植物化學分析

由于20%和30%乙醇洗脫組分具有更高的黃酮類化合物含量（圖7A）及更佳的生物活性，我們通過全植物靶向代謝組學分析了這兩組混合物的植物化學成分?？偣茶b定出1257種化合物，主要分為黃酮類(73.83%)、多酚類、生物堿類、植物激素類、萜類、芳香族化合物、酮酸類、脂肪酰類、維生素類、核苷酸類及其他類別（圖7B-C）。

在黃酮類化合物中，(+)-表兒茶素(24.94%)、異槲皮素(14.02%)、山柰酚(7.66%)、山柰酚-3-O-蕓香糖苷(6.84%)、兒茶素B2(5.51%)為主要成分（圖7D）。其中，表兒茶素、異槲皮素等可高效清除自由基；槲皮素、蘆丁和兒茶素可抑制α-葡萄糖苷酶，黃烷醇類等降低二型糖尿病風險；槲皮素、蘆丁等可減少高Fe²?引起的溶血。此外，ATF黃酮類成分已被證實用于蜂膠、蜂糧等健康產品，且能緩解功能性便秘。

該部分內容驗證了ATF的體外抗氧化和降血糖活性，為其在食品、醫藥領域的進一步開發提供了科學依據。

圖7. 基于廣泛靶向代謝組學的ATF主要化學成分
 

研究結論

在本研究中，作者開發了一種高效的ATF提取與純化方法，并對ATF提取物的體外抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性進行了評估。確定的最佳提取條件為：乙醇濃度60%、料液比1:39(w/v)、超聲功率、時間和溫度分別為160W、47分鐘和69°C。ATF粗提物(ATEE)的黃酮得率達3.33%。通過HPD300樹脂的純化效率優于其他大孔樹脂(MRs)，且其吸附等溫線符合Freundlich吸附模型。在優化后的HPD300吸附條件下，使用0%至50%不同濃度的乙醇洗脫可分離出黃酮含量較高的組分。20%和30%乙醇洗脫組分的黃酮含量均超過90%，表現出增強的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制能力。20%和30%乙醇洗脫組分的主要黃酮成分包括表兒茶素、異槲皮素、木犀草素-3-O-蕓香糖苷、兒茶素B2和蘆丁等。這些發現為ATF的高效制備及AT資源的深度開發與利用提供了理論依據。

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END

Run動 撰文

Weyne 校稿