Cell子刊｜揚州大學劉源教授和王志強教授研究團隊新發現：運動竟能讓腸道微生物群聯手益生菌完勝超級細菌！

英文標題：Exercise-driven gut microbiota alterations enhance colonization resistance against methicillin-resistant Staphylococcus aureus

中文標題：運動驅動的腸道微生物群改變增強了對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的定植抗性

發表期刊：Cell Reports

影響因子：7.5

客戶單位：揚州大學

百趣提供服務：非靶標代謝流

腸道微生物群在抵抗病原體入侵方面起著至關重要的作用，特別是對公眾健康構成重大威脅的多藥耐藥(multidrug-resistant, MDR)細菌。雖然運動提供了許多健康益處，但其對宿主定植抗性的影響在很大程度上尚不清楚。最近，揚州大學劉源教授和王志強教授研究團隊在權威期刊Cell Reports發表了題為“Exercise-driven gut microbiota alterations enhance colonization resistance against methicillin-resistant Staphylococcus aureus”的研究論文。研究發現適度運動可顯著減少耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的腸道定植，MRSA是一種臨床上重要的MDR病原體。此外，研究者還鑒定了一種未充分研究的腸道益生菌Dubosiella newyorkensis(L8)菌株作為介導運動誘導的抗MRSA定植抗性的關鍵因子。從機制上講，L8增強了巖藻糖的剝奪，是MRSA生長和致病性所必需的關鍵碳源。這一過程依賴于丙酮酸對L8中乳酸脫氫酶的ILE257位點的高結合親和力?？傊?，該項研究強調了適度運動在維持宿主定植抗性中的重要性，并證明了L8作為益生菌在保護免受MRSA定植中的作用。

1、適度運動可減少小鼠腸道中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的定植

為探討不同運動水平對腸道耐藥菌感染的影響，本研究首先采用八通道跑輪疲勞裝置建立小鼠正常運動(E)和過度運動(EE)模型，并對模型小鼠進行運動負荷試驗（圖1A）。研究者監測了三組雌性和雄性小鼠的體重，發現沒有顯著差異（圖1B）。同時，研究者分析了小鼠運動后的血糖水平，結果顯示 E 組和 EE 組的血糖水平低于正常組（N組），證實了小鼠運動模型的成功建立。隨后，選取兩種代表性多重耐藥菌株（MRSA T144和大腸桿菌B2）感染小鼠，建立小鼠感染模型（圖1C）。在雄性小鼠中，在48h時觀察到N組和EE組之間的顯著差異，相比之下，N和EE組雌性動物無顯著變化（圖1D），這表明過度運動可能會削弱雌性小鼠對MRSA T144的抗性。相反，在雄性或雌性小鼠中，大腸桿菌B2的腸道定植在各組之間沒有顯著差異（圖1E）。熱圖可視化證實了可變的MRSA T144負荷，但對于大腸桿菌B2沒有，這表明適度的運動可以減少腸道MRSA T144定植（圖1F）。緊接著，使用含抗生素飲用水的5天方案建立了腸道菌群清除模型（圖1G）。正如所預期的，在沒有腸道菌群的情況下，雄性和雌性小鼠中所有組的MRSA T144負載量相當（圖1H），表明運動引起的腸道微生物群改變有助于小鼠腸道對MRSA T144的定植抗性(colonization resistance, CR)。這些發現強調了適度運動在增強宿主對MRSA感染的定植抗性中的作用。

2、適度運動小鼠腸道中D. newyorkensis豐度增加

為了研究運動介導的腸道微生物群組成的改變，研究者進行了16S rRNA測序分析。在門水平上，觀察到三個組之間的組成差異。在屬的水平上，確定了前20個屬，其中Lactobacillaceae、Muribaculaceae和Erysipelotrichaceae是最豐富的科（圖2A-B）。Erysipelotrichaceae包含Faecalibaculum、Dubosiella和Turicibacter屬，是物種最豐富的科。其中，E組中的Dubosiella明顯多于N組，并且Dubosiella在屬水平上的p值也最?。▓D2D）。  此外，使用線性判別分析(LDA)評分（圖2E）和物種水平的p值構建維恩圖，使用Dubosiella屬作為篩選條件，僅從15個物種中篩選出了D. newyorkensis（圖2F）。通過比較E和EE組與N組之間的LDA發現Dubosiella是一種常見細菌，提示其可能為潛在生物標志物。并且通過維恩圖（圖2G）整合隨機森林分析、物種豐度百分比分析和LDA評分，表明三個群體中均存在D. newyorkensis和uncultured_bacterium_g_Dubosiella。

有趣的是，在三組小鼠中，在兩種性別中，E組豐度高于N組（圖2H）。在雄性小鼠中，EE組的豐度高于E組，而在雌性小鼠中，則恰恰相反（圖2H）。一致地，相關性分析證實了在雄性和雌性小鼠中D. newyorkensis豐度和MRSA T144載量之間的顯著負相關性（圖2J）。這些結果表明，運動小鼠中的D. Newyorkensis豐度可能對調節宿主對MRSA T144感染的CR至關重要。

3、D. newyorkensis的預定植加速MRSA從腸道的清除

為了確定D. newyorkensis對MRSA的保護作用，研究者從小鼠糞便中分離出D. newyorkensis(L8)，并在MRSA感染前連續灌胃給小鼠3天（圖3A）。結果發現，在感染后24h和48h，L8處理組中的MRSA T144細菌載量與對照組相比顯著降低（圖3B）。此外，研究者還評估了腸道病理學，發現對照組的小腸顯示粘液質地和顯著出血（圖3C）。在MRSA T144灌胃后48h，H&E染色顯示對照組的十二指腸絨毛破裂，伴有炎性浸潤；相反，L8組保持完整的絨毛結構并表現出較低的組織學評分（圖3D-E, 圖3G）。通過免疫組化評估ZO-1的蛋白表達（圖3F），而通過WB評估閉合蛋白和緊密連接蛋白-1的表達（圖3H）。與對照組相比，L8組中這些緊密連接蛋白的蛋白質和mRNA水平均明顯更高（圖3I-K）。酶聯免疫分析顯示對照組十二腸中的抗炎因子水平降低，促炎因子水平升高（圖3L-M）。進一步通過H&E染色評估了結腸病理學，結果顯示對照組結腸褶皺萎縮、腸壁變薄和大量炎癥性滲透；相比之下，L8組保持了完整的褶皺結構（圖3N）。阿爾新藍染色發現對照組中結腸杯狀細胞減少（圖3O）。免疫熒光（圖3P-Q）和RT-qPCR分析（圖3R）所示，由杯狀細胞分泌以維持粘液穩態并支持腸壁微生物群的Muc2蛋白在對照組中顯著減少。結腸的酶聯免疫分析結果也表明對照組的抗炎因子減少，促炎因子增加（圖3S-T）?？偠灾@些發現表明L8的預定植有助于維持腸道屏障完整性并減少小鼠腸道中的MRSA T144定植。

4、MRSA腸道定植高度依賴碳源

為了確定支持MRSA T144在腸道中持續存在的關鍵營養來源，研究者進行了代謝組學分析。對雄性和雌性小鼠的糞便代謝物進行KEGG分析，揭示了它們參與各種途徑，包括新陳代謝，藥物開發和細胞過程等（圖4A）?；鹕綀D鑒定了N組和E組雄性和雌性小鼠中的差異代謝物（圖4B-C）。并且考慮到代謝途徑的優勢，利用Sankey圖描繪E和N組中雄性和雌性小鼠的代謝途徑中差異代謝物的次級分類途徑（圖4D）。由于糖脂代謝物是細菌的主要能量來源，研究者將重點放在與MRSA T144正相關的糖脂代謝物上（圖4G）。為了確定MRSA T144對特定代謝物的依賴性，研究者在CM/M9基本培養基中培養了細菌。結果表明，巖藻糖是最有效的促生長代謝物，與葡萄糖的作用相似（圖4H）?；鹕綀D還顯示，與N組相比，E組和EE組雄性和雌性小鼠的巖藻糖均顯著下調（圖4B-C, 圖4E-F）。熱圖表明E組和EE組的巖藻糖水平相對較低，這表明巖藻糖被運動小鼠中豐度顯著增加的細菌耗盡（圖4I）。此外，巖藻糖與金黃色葡萄球菌T144載量表現出顯著的正相關性（圖4J）?？偠灾@些發現表明，巖藻糖作為碳源是支持小鼠腸道中耐藥性金黃色葡萄球菌T144持續定植的關鍵因素。

5、巖藻糖有利于MRSA的生長和毒力

緊接著，研究者在CM培養基中添加了不同濃度的巖藻糖和葡萄糖作為碳源。結果發現，在營養有限的環境中，MRSA T144對巖藻糖的依賴性大于葡萄糖；相反，在營養豐富的培養基中，發現巖藻糖和葡萄糖的促生長作用相當（圖5A）。為了評估巖藻糖對MRSA T144的代謝影響，研究者定量了NAD⁺、NADH和ATP水平。結果發現，巖藻糖的存在導致ATP顯著增加（圖5B），NADH升高（圖5D），NAD⁺降低（圖5D），NAD⁺/NADH比率降低（圖5C）。鑒于NADH是在三羧酸(TCA)循環中由NAD⁺產生的，這些結果表明巖藻糖增強了MRSA T144中通過TCA循環的代謝通量，從而激活細菌代謝。流式細胞術進一步證實巖藻糖促進MRSA T144的活力（圖5E-G）。此外，研究者還研究了巖藻糖補充對MRSA T144毒力和致病性的影響。結果發現，顯著增強生物膜完整性并增加活菌載量（圖5I-J）。超高分辨率共聚焦顯微鏡還揭示了在巖藻糖存在下MRSA T144加速的生物膜形成（圖5H）。MRSA毒力的直接介質被巖藻糖上調，增強了細菌對全血和H₂O₂的抗性（圖5K-M）。在體內，巖藻糖降低了MRSA T144的半數致死劑量（圖5N-P）并增加了MRSA T144的腸負荷，同時加劇了由MRSA T144誘導的腸屏障損傷?？傊?，這些體外和體內的驗證結果共同強調了巖藻糖作為MRSA生長和毒力的碳源的重要性。

6、L8的DH特異性結合位點ILE 257驅動CR對抗MRSA

細菌生長曲線的結果表明，添加巖藻糖也有助于L8的生長（圖6A）。為了研究L8和MRSA T144之間是否存在碳源競爭，兩種菌株分別在CMF和CMCF培養基中在缺氧條件下共培養。結果均表明，在培養基中存在L8時，MRSA T144的細菌載量顯著降低（圖6B），表明L8和MRSA T144之間存在競爭。

為了進一步探索L8如何競爭性地利用巖藻糖，將C¹³標記的巖藻糖添加到CM培養基中，并在4h和16h使用穩定同位素技術通過非靶標代謝流分析L8中巖藻糖的細胞內流動（圖6C）。預測了L8中巖藻糖的細胞內流動，發現巖藻糖在L8胞質中代謝為丙酮酸，然后分別進入由乳酸脫氫酶(LDH)和丙酮酸脫氫酶(PDH)催化的糖酵解和TCA途徑（圖6D）。與16h相比，4h時丙酮酸相對豐度的趨勢與乳酸一致，與TCA循環的中間體相反（圖6D-E）。此外，巖藻糖的添加降低了L8的丙酮酸含量（圖6F），表明通過LDH催化的糖酵解的高丙酮酸消耗。為了更深入地了解其作用機制，研究者將L8菌株的LDH與MRSA T144菌株的LDH進行了氨基酸序列比較，發現兩者的相似性僅為61.73%（圖6J），表明LDH是物種特異性的。此外，研究者通過分子對接分析了丙酮酸和LDH的氨基酸結合位點（圖6K-L），結果顯示LDH的CYS256和ILE257結合位點是唯一的。

為驗證ILE257是導致L8中較高LDH活性的關鍵氨基酸位點，研究者通過同源重組技術將來自L8的LDH引入大腸桿菌BL21中，并將ILE257突變為VAL257，然后將其與MRSA T144共培養（圖6M）。結果發現在需氧和厭氧環境中，與大腸桿菌BL21-pET28a組相比，大腸桿菌BL 21-pET 28a-LDH組中MRSA T144的細菌載量顯著降低（圖6N）。然而，在將ILE突變為VAL后，這種抑制作用被消除（圖6N）?？傊?，研究結果表明L8中的LDH特異性ILE257位點增強了丙酮酸的利用，從而賦予了針對MRSA的競爭優勢和腸道CR。

腸道微生物群介導的定植抗性在抵御入侵病原體方面起著至關重要的作用。本研究發現適度運動可以通過重塑腸道微生物群來增強機體對耐藥菌感染的定植抗性。其中，L8通過競爭關鍵碳源巖藻糖來抑制MRSA的生長和致病性。這一過程依賴于L8乳酸脫氫酶(LDH)中丙酮酸與ILE257位點的高結合親和力。本研究強調了適度運動在維持宿主定植抗性中的重要性，并提出了一種基于微生物組的營養耗竭策略，以對抗多重耐藥細菌感染。