英文標(biāo)題：Exercise-driven gut microbiota alterations enhance colonization resistance against methicillin-resistant Staphylococcus aureus

中文標(biāo)題：運(yùn)動(dòng)驅(qū)動(dòng)的腸道微生物群改變增強(qiáng)了對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的定植抗性

發(fā)表期刊：Cell Reports

影響因子：7.5

客戶單位：揚(yáng)州大學(xué)

百趣提供服務(wù)：非靶標(biāo)代謝流

腸道微生物群在抵抗病原體入侵方面起著至關(guān)重要的作用，特別是對(duì)公眾健康構(gòu)成重大威脅的多藥耐藥(multidrug-resistant, MDR)細(xì)菌。雖然運(yùn)動(dòng)提供了許多健康益處，但其對(duì)宿主定植抗性的影響在很大程度上尚不清楚。最近，揚(yáng)州大學(xué)劉源教授和王志強(qiáng)教授研究團(tuán)隊(duì)在權(quán)威期刊Cell Reports發(fā)表了題為“Exercise-driven gut microbiota alterations enhance colonization resistance against methicillin-resistant Staphylococcus aureus”的研究論文。研究發(fā)現(xiàn)適度運(yùn)動(dòng)可顯著減少耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的腸道定植，MRSA是一種臨床上重要的MDR病原體。此外，研究者還鑒定了一種未充分研究的腸道益生菌Dubosiella newyorkensis(L8)菌株作為介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的抗MRSA定植抗性的關(guān)鍵因子。從機(jī)制上講，L8增強(qiáng)了巖藻糖的剝奪，是MRSA生長和致病性所必需的關(guān)鍵碳源。這一過程依賴于丙酮酸對(duì)L8中乳酸脫氫酶的ILE257位點(diǎn)的高結(jié)合親和力。總之，該項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了適度運(yùn)動(dòng)在維持宿主定植抗性中的重要性，并證明了L8作為益生菌在保護(hù)免受MRSA定植中的作用。

1、適度運(yùn)動(dòng)可減少小鼠腸道中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的定植

為探討不同運(yùn)動(dòng)水平對(duì)腸道耐藥菌感染的影響，本研究首先采用八通道跑輪疲勞裝置建立小鼠正常運(yùn)動(dòng)(E)和過度運(yùn)動(dòng)(EE)模型，并對(duì)模型小鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)負(fù)荷試驗(yàn)（圖1A）。研究者監(jiān)測了三組雌性和雄性小鼠的體重，發(fā)現(xiàn)沒有顯著差異（圖1B）。同時(shí)，研究者分析了小鼠運(yùn)動(dòng)后的血糖水平，結(jié)果顯示 E 組和 EE 組的血糖水平低于正常組（N組），證實(shí)了小鼠運(yùn)動(dòng)模型的成功建立。隨后，選取兩種代表性多重耐藥菌株（MRSA T144和大腸桿菌B2）感染小鼠，建立小鼠感染模型（圖1C）。在雄性小鼠中，在48h時(shí)觀察到N組和EE組之間的顯著差異，相比之下，N和EE組雌性動(dòng)物無顯著變化（圖1D），這表明過度運(yùn)動(dòng)可能會(huì)削弱雌性小鼠對(duì)MRSA T144的抗性。相反，在雄性或雌性小鼠中，大腸桿菌B2的腸道定植在各組之間沒有顯著差異（圖1E）。熱圖可視化證實(shí)了可變的MRSA T144負(fù)荷，但對(duì)于大腸桿菌B2沒有，這表明適度的運(yùn)動(dòng)可以減少腸道MRSA T144定植（圖1F）。緊接著，使用含抗生素飲用水的5天方案建立了腸道菌群清除模型（圖1G）。正如所預(yù)期的，在沒有腸道菌群的情況下，雄性和雌性小鼠中所有組的MRSA T144負(fù)載量相當(dāng)（圖1H），表明運(yùn)動(dòng)引起的腸道微生物群改變有助于小鼠腸道對(duì)MRSA T144的定植抗性(colonization resistance, CR)。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了適度運(yùn)動(dòng)在增強(qiáng)宿主對(duì)MRSA感染的定植抗性中的作用。

2、適度運(yùn)動(dòng)小鼠腸道中D. newyorkensis豐度增加

為了研究運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)的腸道微生物群組成的改變，研究者進(jìn)行了16S rRNA測序分析。在門水平上，觀察到三個(gè)組之間的組成差異。在屬的水平上，確定了前20個(gè)屬，其中Lactobacillaceae、Muribaculaceae和Erysipelotrichaceae是最豐富的科（圖2A-B）。Erysipelotrichaceae包含Faecalibaculum、Dubosiella和Turicibacter屬，是物種最豐富的科。其中，E組中的Dubosiella明顯多于N組，并且Dubosiella在屬水平上的p值也最小（圖2D）。  此外，使用線性判別分析(LDA)評(píng)分（圖2E）和物種水平的p值構(gòu)建維恩圖，使用Dubosiella屬作為篩選條件，僅從15個(gè)物種中篩選出了D. newyorkensis（圖2F）。通過比較E和EE組與N組之間的LDA發(fā)現(xiàn)Dubosiella是一種常見細(xì)菌，提示其可能為潛在生物標(biāo)志物。并且通過維恩圖（圖2G）整合隨機(jī)森林分析、物種豐度百分比分析和LDA評(píng)分，表明三個(gè)群體中均存在D. newyorkensis和uncultured_bacterium_g_Dubosiella。

有趣的是，在三組小鼠中，在兩種性別中，E組豐度高于N組（圖2H）。在雄性小鼠中，EE組的豐度高于E組，而在雌性小鼠中，則恰恰相反（圖2H）。一致地，相關(guān)性分析證實(shí)了在雄性和雌性小鼠中D. newyorkensis豐度和MRSA T144載量之間的顯著負(fù)相關(guān)性（圖2J）。這些結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)小鼠中的D. Newyorkensis豐度可能對(duì)調(diào)節(jié)宿主對(duì)MRSA T144感染的CR至關(guān)重要。

3、D. newyorkensis的預(yù)定植加速M(fèi)RSA從腸道的清除

為了確定D. newyorkensis對(duì)MRSA的保護(hù)作用，研究者從小鼠糞便中分離出D. newyorkensis(L8)，并在MRSA感染前連續(xù)灌胃給小鼠3天（圖3A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在感染后24h和48h，L8處理組中的MRSA T144細(xì)菌載量與對(duì)照組相比顯著降低（圖3B）。此外，研究者還評(píng)估了腸道病理學(xué)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的小腸顯示粘液質(zhì)地和顯著出血（圖3C）。在MRSA T144灌胃后48h，H&E染色顯示對(duì)照組的十二指腸絨毛破裂，伴有炎性浸潤；相反，L8組保持完整的絨毛結(jié)構(gòu)并表現(xiàn)出較低的組織學(xué)評(píng)分（圖3D-E, 圖3G）。通過免疫組化評(píng)估ZO-1的蛋白表達(dá)（圖3F），而通過WB評(píng)估閉合蛋白和緊密連接蛋白-1的表達(dá)（圖3H）。與對(duì)照組相比，L8組中這些緊密連接蛋白的蛋白質(zhì)和mRNA水平均明顯更高（圖3I-K）。酶聯(lián)免疫分析顯示對(duì)照組十二腸中的抗炎因子水平降低，促炎因子水平升高（圖3L-M）。進(jìn)一步通過H&E染色評(píng)估了結(jié)腸病理學(xué)，結(jié)果顯示對(duì)照組結(jié)腸褶皺萎縮、腸壁變薄和大量炎癥性滲透；相比之下，L8組保持了完整的褶皺結(jié)構(gòu)（圖3N）。阿爾新藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)對(duì)照組中結(jié)腸杯狀細(xì)胞減少（圖3O）。免疫熒光（圖3P-Q）和RT-qPCR分析（圖3R）所示，由杯狀細(xì)胞分泌以維持粘液穩(wěn)態(tài)并支持腸壁微生物群的Muc2蛋白在對(duì)照組中顯著減少。結(jié)腸的酶聯(lián)免疫分析結(jié)果也表明對(duì)照組的抗炎因子減少，促炎因子增加（圖3S-T）。總而言之，這些發(fā)現(xiàn)表明L8的預(yù)定植有助于維持腸道屏障完整性并減少小鼠腸道中的MRSA T144定植。

4、MRSA腸道定植高度依賴碳源

為了確定支持MRSA T144在腸道中持續(xù)存在的關(guān)鍵營養(yǎng)來源，研究者進(jìn)行了代謝組學(xué)分析。對(duì)雄性和雌性小鼠的糞便代謝物進(jìn)行KEGG分析，揭示了它們參與各種途徑，包括新陳代謝，藥物開發(fā)和細(xì)胞過程等（圖4A）。火山圖鑒定了N組和E組雄性和雌性小鼠中的差異代謝物（圖4B-C）。并且考慮到代謝途徑的優(yōu)勢，利用Sankey圖描繪E和N組中雄性和雌性小鼠的代謝途徑中差異代謝物的次級(jí)分類途徑（圖4D）。由于糖脂代謝物是細(xì)菌的主要能量來源，研究者將重點(diǎn)放在與MRSA T144正相關(guān)的糖脂代謝物上（圖4G）。為了確定MRSA T144對(duì)特定代謝物的依賴性，研究者在CM/M9基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)了細(xì)菌。結(jié)果表明，巖藻糖是最有效的促生長代謝物，與葡萄糖的作用相似（圖4H）。火山圖還顯示，與N組相比，E組和EE組雄性和雌性小鼠的巖藻糖均顯著下調(diào)（圖4B-C, 圖4E-F）。熱圖表明E組和EE組的巖藻糖水平相對(duì)較低，這表明巖藻糖被運(yùn)動(dòng)小鼠中豐度顯著增加的細(xì)菌耗盡（圖4I）。此外，巖藻糖與金黃色葡萄球菌T144載量表現(xiàn)出顯著的正相關(guān)性（圖4J）。總而言之，這些發(fā)現(xiàn)表明，巖藻糖作為碳源是支持小鼠腸道中耐藥性金黃色葡萄球菌T144持續(xù)定植的關(guān)鍵因素。

5、巖藻糖有利于MRSA的生長和毒力

緊接著，研究者在CM培養(yǎng)基中添加了不同濃度的巖藻糖和葡萄糖作為碳源。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在營養(yǎng)有限的環(huán)境中，MRSA T144對(duì)巖藻糖的依賴性大于葡萄糖；相反，在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)巖藻糖和葡萄糖的促生長作用相當(dāng)（圖5A）。為了評(píng)估巖藻糖對(duì)MRSA T144的代謝影響，研究者定量了NAD⁺、NADH和ATP水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巖藻糖的存在導(dǎo)致ATP顯著增加（圖5B），NADH升高（圖5D），NAD⁺降低（圖5D），NAD⁺/NADH比率降低（圖5C）。鑒于NADH是在三羧酸(TCA)循環(huán)中由NAD⁺產(chǎn)生的，這些結(jié)果表明巖藻糖增強(qiáng)了MRSA T144中通過TCA循環(huán)的代謝通量，從而激活細(xì)菌代謝。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證實(shí)巖藻糖促進(jìn)MRSA T144的活力（圖5E-G）。此外，研究者還研究了巖藻糖補(bǔ)充對(duì)MRSA T144毒力和致病性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，顯著增強(qiáng)生物膜完整性并增加活菌載量（圖5I-J）。超高分辨率共聚焦顯微鏡還揭示了在巖藻糖存在下MRSA T144加速的生物膜形成（圖5H）。MRSA毒力的直接介質(zhì)被巖藻糖上調(diào)，增強(qiáng)了細(xì)菌對(duì)全血和H₂O₂的抗性（圖5K-M）。在體內(nèi)，巖藻糖降低了MRSA T144的半數(shù)致死劑量（圖5N-P）并增加了MRSA T144的腸負(fù)荷，同時(shí)加劇了由MRSA T144誘導(dǎo)的腸屏障損傷。總之，這些體外和體內(nèi)的驗(yàn)證結(jié)果共同強(qiáng)調(diào)了巖藻糖作為MRSA生長和毒力的碳源的重要性。

6、L8的DH特異性結(jié)合位點(diǎn)ILE 257驅(qū)動(dòng)CR對(duì)抗MRSA

細(xì)菌生長曲線的結(jié)果表明，添加巖藻糖也有助于L8的生長（圖6A）。為了研究L8和MRSA T144之間是否存在碳源競爭，兩種菌株分別在CMF和CMCF培養(yǎng)基中在缺氧條件下共培養(yǎng)。結(jié)果均表明，在培養(yǎng)基中存在L8時(shí)，MRSA T144的細(xì)菌載量顯著降低（圖6B），表明L8和MRSA T144之間存在競爭。

為了進(jìn)一步探索L8如何競爭性地利用巖藻糖，將C¹³標(biāo)記的巖藻糖添加到CM培養(yǎng)基中，并在4h和16h使用穩(wěn)定同位素技術(shù)通過非靶標(biāo)代謝流分析L8中巖藻糖的細(xì)胞內(nèi)流動(dòng)（圖6C）。預(yù)測了L8中巖藻糖的細(xì)胞內(nèi)流動(dòng)，發(fā)現(xiàn)巖藻糖在L8胞質(zhì)中代謝為丙酮酸，然后分別進(jìn)入由乳酸脫氫酶(LDH)和丙酮酸脫氫酶(PDH)催化的糖酵解和TCA途徑（圖6D）。與16h相比，4h時(shí)丙酮酸相對(duì)豐度的趨勢與乳酸一致，與TCA循環(huán)的中間體相反（圖6D-E）。此外，巖藻糖的添加降低了L8的丙酮酸含量（圖6F），表明通過LDH催化的糖酵解的高丙酮酸消耗。為了更深入地了解其作用機(jī)制，研究者將L8菌株的LDH與MRSA T144菌株的LDH進(jìn)行了氨基酸序列比較，發(fā)現(xiàn)兩者的相似性僅為61.73%（圖6J），表明LDH是物種特異性的。此外，研究者通過分子對(duì)接分析了丙酮酸和LDH的氨基酸結(jié)合位點(diǎn)（圖6K-L），結(jié)果顯示LDH的CYS256和ILE257結(jié)合位點(diǎn)是唯一的。

為驗(yàn)證ILE257是導(dǎo)致L8中較高LDH活性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，研究者通過同源重組技術(shù)將來自L8的LDH引入大腸桿菌BL21中，并將ILE257突變?yōu)閂AL257，然后將其與MRSA T144共培養(yǎng)（圖6M）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在需氧和厭氧環(huán)境中，與大腸桿菌BL21-pET28a組相比，大腸桿菌BL 21-pET 28a-LDH組中MRSA T144的細(xì)菌載量顯著降低（圖6N）。然而，在將ILE突變?yōu)閂AL后，這種抑制作用被消除（圖6N）。總之，研究結(jié)果表明L8中的LDH特異性ILE257位點(diǎn)增強(qiáng)了丙酮酸的利用，從而賦予了針對(duì)MRSA的競爭優(yōu)勢和腸道CR。

腸道微生物群介導(dǎo)的定植抗性在抵御入侵病原體方面起著至關(guān)重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)適度運(yùn)動(dòng)可以通過重塑腸道微生物群來增強(qiáng)機(jī)體對(duì)耐藥菌感染的定植抗性。其中，L8通過競爭關(guān)鍵碳源巖藻糖來抑制MRSA的生長和致病性。這一過程依賴于L8乳酸脫氫酶(LDH)中丙酮酸與ILE257位點(diǎn)的高結(jié)合親和力。本研究強(qiáng)調(diào)了適度運(yùn)動(dòng)在維持宿主定植抗性中的重要性，并提出了一種基于微生物組的營養(yǎng)耗竭策略，以對(duì)抗多重耐藥細(xì)菌感染。