類器官培養50問-基礎篇

Q1: 類器官培養對于起始細胞的來源有要求嗎？

A1: 目前培養的類器官主要來源于上皮細胞，對于非上皮細胞來源的類器官培養方式還需要進一步研究。

Q2: 類器官按照起始細胞的類型，分為幾種呢？

A2: 常見的類器官根據起始細胞的類型，可以分為兩種：
（1）腫瘤組織來源的腫瘤類器官；
（2）干細胞來源的類器官，包括：多能性干細胞 (PSC) /成體干細胞 (ASC)以及誘導多能干細胞(iPSC)。

Q3: 類器官是由單一種類細胞組成的嗎？

A3: 類器官并不是單一細胞組成的結構，而是由具有干細胞性質的起始細胞進行分裂和分化，并將多種類型的細胞自組裝的結構，自組裝后的形態和功能與體內相應器官相似。

Q4：在沒有新鮮組織的情況下，可以用凍存組織提取的原代細胞進行3D培養嗎？

A4：可以的。已有學者驗證過，將人結腸癌、甲狀腺癌、肺癌、腎癌和肝癌的手術組織切碎后，以梯度降溫的方式進行冷凍，最終在液氮中保存15-18個月后進行復蘇和原代細胞提取，分別對細胞進行2D和3D培養，證實了凍存對于細胞活力和生長速度均無顯著影響^【1】。
當然，由于組織來源不同、凍存條件不同，還需要大家根據實際情況進行驗證，新鮮組織提取的細胞依然是3D培養的最佳選擇。

Q5：類器官可以像細胞一樣進行凍存和復蘇嗎？

A5：類器官可以凍存，通常會在傳代2-3次之后選擇凍存。為了達到最佳的效果，可以選擇類器官成熟（傳代7-10次）后再進行凍存。

Q6：類器官的尺寸需要進行控制嗎？

A6：是的，主要的原因是類器官內部缺乏循環系統。
當類器官的尺寸較大時，靠近中心的細胞難以和外界進行氧氣和營養成分的交換。因此這個結構尺寸越大，死亡的細胞就越多（如圖1）^【2】。我們在培養的過程中，需要控制類器官的大小在4-5mm以內。未來的類器官技術可以與血管類器官結合在一起，建立一個功能性的封閉循環系統，用以培養出更大尺寸的類器官。

Q7：類器官傳代的標準是什么？

A7：類器官的傳代通常是根據培養的時間判斷。
一般在7-14天時進行第一次傳代，后續則每7-10天傳代一次^【3】。

Q8：類器官可以進行多少次傳代？

A8：大部分類器官可以在體外連續傳代10次（>6個月），甚至有些類器官可以連續傳代20次（>12個月）并且維持原有的生長速度^【4】。

Q9: 鑒定類器官的方法有哪些？

A9: 初步可以通過顯微鏡和H&E染色觀察形態；然后可以用Western Blot、qRT-PCR、免疫熒光、流式細胞術檢測該類器官是否表達相應的biomarker；基因測序可以鑒定所培養的類器官是否有某些特征丟失；對于部分類器官，還可以檢測其是否具有功能，例如：已有研究檢測出胃類器官可以分泌胃酸，心臟類器官可以自主跳動。

Q10: 類器官是如何按照我們的意愿進行定向分化的？

A10: 在進行類器官培養前，我們需要了解該器官在體內的發育過程，及早期發育相關的信號通路。
以胃類器官培養為例：胃由前后腸發育而來，早期發育需要由多種信號通路共同調控。那么在體外我們需要通過添加細胞因子的方式，指導激活/抑制相應的信號通路，來達到相同的效果，如： PSCs在Activin A的作用下分化為內胚層，Wnt3a、FGF-4和Noggin指導細胞向向前腸分化^【5】。

參考文獻

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類器官培養50問-PDO篇

Q11：對于病人的腫瘤組織，需要怎樣處理盡量避免污染？

A11：1、將腫瘤組織置于70%-75%乙醇中30秒，清洗表面血塊等雜物，并用剪刀對組織稍加修整。

2、放入含有青/鏈霉素、兩性霉素B、慶大霉素（單獨使用某一種或幾種組合）的PBS緩沖液進行進一步清洗。

3、原代細胞提取前，建議先進行支原體檢測，防止支原體污染。

Q12：PDO對于藥敏反應的準確度是怎樣的呢？

A12：有數據表明，PDO對藥敏反應的陽性預測值（預測某一特定藥物有效）為88%，陰性預測值（預測某一特定藥物無效）為100%，敏感性達100%，特異性為93%^【1】。

Q13：病灶和癌旁培養出的類器官有差別嗎？腫瘤組織的取材部位有什么要求？

A13：原發病灶和癌旁來源的腫瘤類器官是有差別的。
如：從形態上看，原發病灶來源的類器官比癌旁來源的類器官更具有侵襲性的結構^【2】。
由于腫瘤具有異質性，因此類器官存在差異也是很常見的。如果想要盡量減小建?；蛩幬锖Y選的誤差，可以考慮多點位取材。

圖1. 原發病灶來源的類器官比癌旁來源的類器官更具有侵襲性的結構^【2】

Q14：PDO培養的成功率是多少？成功率和是否進行治療有關系嗎？

A14：不同類型來源的PDO成功率略有不同，大部分的PDO培養成功率在63%-70%左右^【1】，并且臨床治療對于這個統計結果影響不大^【3】。通過縮短樣本離體時間和操作步驟，可以適當提高成功率。

Q15：凍存多長時間內的組織可以用于類器官培養？

A15：對于凍存在-80℃的組織，6周之內復蘇并進行類器官培養是最佳選擇^【4】。當然如果是保存在液氮中，保存的時間可以更久一些。

Q16：原代細胞提取時，通常會混有增殖非常迅速的成纖維細胞，應該怎樣快速去除呢？

A16：成纖維細胞主要有兩種去除方式：
1、鑒于成纖維細胞貼壁不牢的性質，可以采用反復貼壁的方式去除大部分成纖維細胞。
2、目前已有商用的成纖維細胞去除試劑，但是否會影響類器官的培養還需要實驗驗證。

Q17：培養腫瘤類器官需要原始腫瘤組織的大小是多少？活檢樣本量足夠嗎？

A17：手術組織大概需要3顆黃豆大小以上，穿刺活檢樣本需要至少3針，內鏡活檢至少鉗取6顆以上。

Q18：從腫瘤組織中提取原代細胞后，發現細胞呈紅色，這是為什么？

A18：紅色主要是由于腫瘤組織中的大量紅細胞所導致的。
首先，可以在拿到組織后盡量多清洗幾次，能夠去除大部分的紅細胞；
其次，可以使用商品化的紅細胞裂解液。紅細胞裂解液的原理是去除無核細胞，因此不會影響其他有核細胞的正常培養。

Q19：怎樣構建含有PDO的腫瘤微環境？

A19：目前構建含有PDO的腫瘤微環境主要有三種方式：

1、將腫瘤組織經過物理或酶解分離后，在細胞外基質(Matrigel或BME)中進行類器官培養；同時分離外源性免疫細胞（通常來源于自體外周血或腫瘤組織），隨后與生長的類器官進行共培養。
2、將腫瘤消化后形成的球狀組織與膠原蛋白混合，并接種到微流體培養裝置中，即腫瘤細胞與樣本中的固有免疫微環境共同培養，形成天然TME模型。
3、將含有免疫細胞的腫瘤組織物理切割成組織碎片，在包被膠原蛋白凝膠的transwell小室中進行培養。凝膠的頂部暴露在空氣中，同時外皿中的培養基通過可滲透的transwell擴散到內皿中，形成氣-液交互界面(air–liquid interface, ALI)。

Q20：由于取到的腫瘤組織太小了，培養的類器官數目不足以進行后續的檢測。我可以將類器官傳代擴增嗎？

A20：對于腫瘤來源的類器官一般是不建議傳代的，因為傳代后的表型會和體內情況略有差異。文獻中的PDO一般會控制在2-3代^【4】，最多不超過5代^【5】。
如果細胞數目太少，傳代5次依然不能滿足測試需求，可以考慮將檢測的方式改變一下，比如從96孔板換成384孔板，甚至更小體系的微流控芯片。

Q21：腫瘤組織中會存在正常細胞嗎？怎么去除這些正常細胞？

A21：即使是肉眼判斷為腫瘤的組織中，也會混有一部分正常細胞。因此在進行類器官培養前，可以先將原代細胞進行流式分選或磁珠分選，得到腫瘤細胞再進行類器官培養。

Q22：正常細胞是否也會生長為類器官？腫瘤類器官培養時怎么去除正常類器官？

A22：由于腫瘤組織中通常混有一些健康細胞，因此培養出的腫瘤類器官很有可能混雜了來源于正常上皮的類器官。為了得到更純的PDO，除了Q1中提到的對原代細胞進行處理外，也可以對類器官群進行“純化”，主要有一下三種途徑^【6】。
1、利用正常類器官和PDO的形態不同，在鏡下進行手動篩選。圖1展示了胃類器官和腫瘤類器官的形態差異：正常的胃類器官呈球形，由單層上皮細胞組成，具有較大的管腔；而腫瘤類器官通常是囊狀，且有多層細胞形態。

2、通過調節培養基中的組分進行篩選。如：大多數胃癌表現出TP53突變，這一突變使PDO表現出對Nutlin-3更耐受，而正常類器官則會死亡。

3、將類器官消化為單個細胞后，流式分選出腫瘤細胞。

Q23：進行藥敏實驗時，需要將PDO從基質膠中消化下來嗎？

A23：可能有很多小伙伴擔心基質膠會阻礙藥物進入到PDO中，但無數實驗已經證明，基質膠內的PDO是可以對藥物進行響應的；而且PDO需要三維結構才能模擬體內狀況，如果沒有了基質膠的支撐，藥敏實驗的準確性會打折扣。

Q24：PDO實驗可以代替動物模型（PDX）嗎？

A24：PDO相較于動物模型有很多優點，例如成本低、耗時短、可以進行大規模培養和實驗等。不過在藥物代謝、癌癥的浸潤、轉移等方向的研究則需要動物實驗來進行。

Q25：在培養過程中，PDO生長情況與之前相比異常，主要表現為生長周期變短，增殖迅速，這是什么原因？

A25：如果PDO在培養過程中突然增殖迅速，可能是某些雜質細胞（如成纖維細胞）的大量生長導致的，此時最好進行切片染色，觀察一下是否存在這些細胞的污染。如果不是這個原因，則考慮是突變引起的，最好進行測序驗證并與初代PDO進行比對。

Q26：怎樣檢測PDO對藥物的敏感性？

A26：主要有兩種途徑進行檢測。
1、進行細胞活力檢測，即線粒體呼吸（耗氧率）、糖酵解 （H+濃度）等；
2、可以通過高內涵成像技術進行分析。

Q27：PDO和腫瘤原代細胞的藥敏實驗濃度范圍相同嗎？

A27：小編查閱了大量的相關文獻，發現PDO的藥物測試有效濃度會整體高于2D細胞，不同種類的PDO之間也存在很大的倍數差異。

Q28：PDO模型可以進行抗體類藥物篩選嗎？

A28：由于抗體類藥物需要免疫細胞的參與，因此單純的PDO模型并不適合?？梢钥紤]在PDO的基礎上建立腫瘤微環境（TME），從而進行抗體類藥物的測試。

Q29：腫瘤細胞系（如Hela細胞系）可以培養成為PDO嗎？

A29：不可以。PDO需要依賴多種細胞在體外的自組裝形成，而腫瘤細胞系沒有自組裝的能力，可能會形成細胞團，但這并不是PDO。

Q30：PDO可以進行建庫嗎？
A10：不論是原發型還是轉移型腫瘤，都可以建立PDO樣本庫。但考慮到PDO的培養并不是百分之百成功的（比如CRC-PDO的培養成功率大約是73%^【7】），因此建庫所需的樣本量會比較大。

參考文獻

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類器官培養50問-應用篇

Q31： 用于疾病研究的類器官需要最大限度減小差異。但在實際培養過程中，同批次類器官個體之間、以及不同批次類器官樣本之間均存在顯著差異，這個問題怎樣克服呢？

A31: 類器官是由不同類型的細胞組成的結構，并且在體外是自組裝的，因此很容易存在同一樣本在相同培養條件下的孔間差異。
如果是用于患者個性化醫療的腫瘤類器官，需要更精準地模擬患者體內的特征，這種情況建議采用多個平行來減小差異；
如果是用于機制研究或用作疾病模型的類器官，可以考慮利用“微流控液滴技術”進行工程化培養，相關成果已發表在Cell Reports Medicine^【1】。

Q32：目前培養出的類器官可以進行體內移植，用于器官重建嗎？

A32：已有動物實驗證實過可行性，比如：腸類器官移植小鼠治療潰瘍性結腸炎^【2】；胰島類器官移植小鼠治療糖尿病^【3】。
雖然目前類器官移植尚未進入臨床，但在2021年2月，Science^【4】首次報道了利用膽道類器官修復離體條件下的人類肝臟，實現了膽道再生，并改善了膽汁性質。

Q33：類器官一般長到什么程度可以用來進行藥物測試？

A33：這個問題可以在Nature Protocols^【5】找到答案。
對于新鮮培養的類器官：建議對低代次類器官（2-3代）進行藥物篩選，以最大限度地減少使用過的培養基或體外突變累積對藥物測試的影響。
對于經過凍存的類器官：由于冷凍/解凍可能導致復蘇時器官樣形態的變化，因此建議類器官至少傳代一次再進行藥物篩選。如果出現復蘇后細胞活力不佳，則需要延長培養時間以恢復細胞狀態。

Q34：類器官建立是否成功有怎樣的標準嗎？

A34：1、判斷形態。顯微鏡下類器官形態可能為空泡狀、出芽狀、緊密型、松散型等，但整體形態一致。
2、可以鑒定相應的biomarker是否有表達，及分布是否與組織切片相似。
3、是否能夠傳代3次以上，并可以凍存復蘇。
4、如果有條件的話，可以進行測序分析。

Q35：類器官可以進行基因編輯嗎？

A35：可以，干細胞來源類器官的基因編輯多用于疾病建模，而腫瘤來源的類器官則多用于尋找疾病相關突變點或治療靶點，圖1列舉了類器官基因編輯的部分研究和應用。

Q36：類器官培養和普通細胞培養有何不同之處？

A36：1、細胞來源有區別：類器官的細胞來源是具有多能性的上皮細胞，而普通細胞培養適用于培養多種類型細胞；

1. 細胞培養方式不同：類器官需要基質膠等材料支撐其三維結構，普通細胞培養則不需要；
2. 類器官需要實現體外分化和自組裝，因此需要多種細胞因子的組合進行誘導，培養基成分復雜。而普通細胞培養通常為單一種類細胞，因此培養基成分較簡單；

Q37：用哪種培養基培養來自轉移部位腫瘤的類器官，比如原發灶為A類型腫瘤，轉移灶為B類型腫瘤？

A37：通常來講，如果腫瘤發生了轉移，我們依然選用相對應的原發灶（A類型）PDO培養基。

Q38: 怎樣證明培養出的結構是類器官，而不是簡單聚集在一起的細胞團？

A38：類器官的分化方式本質上是在模擬體內的器官發育，因此表達形態及各細胞分布情況與實際器官具有相似性，而細胞團則沒有這種規律。我們可以通過免疫熒光的方式檢測biomarkers的分布情況來區分。例如下圖中的結果表明，腎類器官與腎組織的biomarkers分布高度一致^【7】。

Q39：類器官的的來源細胞必須要具有多能性嗎？正常組織成熟體細胞可以進行類器官培養嗎？

A39：由于類器官涉及到體外分化和自組裝，因此來源細胞必須具有多能性。正常組織的成熟體細胞中往往會有一部分成體干細胞（標志物為Lgr5，CD133等），這部分細胞也可以進行類器官培養。

Q40：可以通過構建條件性培養基代替商品化的細胞因子嗎？

A40：依據Hans Clevers實驗室早期發表的文章，可以采用條件性培養基代替純化的細胞因子進行類器官培養，但同時也需要考慮條件性培養基的不足之處。小編總結了條件性培養基和近岸細胞因子的參數差異。

總的來說，條件性培養基對于部分預實驗或少量類器官培養是可行的，但鑒于質粒構建和驗證消耗的時間，以及檢測過程涉及的抗體、qPCR等成本也是需要考慮在內的。同時，細胞代謝產物、內毒素和宿主殘留物等也有可能影響實驗結果。因此，選用高品質的商品化細胞因子能夠幫您節約時間和金錢成本，快速推動類器官培養進程。

參考文獻

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類器官培養50問-實際操作篇

Q41: 按照文獻方法進行類器官培養，為什么觀察到的形態卻和文獻不一致？

A41: 決定類器官形態的因素有很多，樣本來源是否相同、選用的細胞因子品質是否有差異都有可能改變最終的類器官形態。這里舉一個文獻中的例子，分別取四個高級別漿液性（HGS）卵巢癌患者的腫瘤組織，用同樣的條件進行類器官培養，H&E染色結果顯示它們的形態千差萬別^【1】。因此對于類器官的鑒定，我們不能局限于形態觀察，需要使用多種方法相結合。

Q42：類器官的藥敏實驗中需要使用DMSO作為藥物的溶劑，需要控制DMSO的用量嗎？

A42：考慮到DMSO這類有機物的細胞毒性，建議終濃度不超過0.1%（v/v）。

Q43：培養過程中發現類器官培養物中有黑色小顆粒，這個是雜質嗎？應該怎樣去除？

A43：黑色小顆粒大概率是雜質或細胞碎片，去除它們有以下兩種方式可以參考：
1、將類器官消化下來，用培養基進行反復清洗，達到稀釋雜質的作用；
2、用無菌手術刀將類器官切成兩半，取1ml注射器吸滿培養基并輕輕推出，沖洗類器官中的雜質^【2】。

Q44：對于腫瘤患者的個性化醫療測試，PDO、PDX、PDXO的模型可以相互結合使用嗎？

A44：PDO、PDX、PDXO模型有各自的優勢，通常有以下兩種結合方式：PDO-PDX和PDX-PDXO。
1、PDO-PDX是性價比更高的方式，即：先利用PDO進行高通量的藥物篩選，篩選出有效的藥物再進行PDX測試。
2、PDX-PDXO是更精準的藥物測試方式，即：先利用PDX產生大量的體內腫瘤，然后將這些腫瘤分離進行PDXO培養，此時可以通過PDX模型，將PDXO的藥敏實驗結果與體內用藥結果一一對應，進而預測人體用藥的結果，實現對患者更精準的用藥指導；并且可以用PDX模型將轉移后的腫瘤分離，同樣進行PDXO培養和用藥，能夠更精確地對轉移灶進行藥物篩選。

Q45：類器官怎么從基質膠中回收？

A45：1、將類器官放置在冰上，待基質膠融化后離心進行回收，這種方式適用于不需要將類器官結構完全打散的情況；
2、市售的細胞回收液，可以溫和有效地獲得細胞懸液，不會損傷細胞或細胞表面蛋白。

Q46：為什么用基質膠來培養類器官？可以用其它類型的凝膠替代嗎？

A46：基質膠能夠為類器官提供支撐作用，目前類器官培養用的基質膠來源于小鼠肉瘤的基底膜基質，其中含有約60%層粘連蛋白、30% IV 膠原和8%的巢蛋白，還含有基底膜聚糖、TGF-?、表皮生長因子、類胰島素生長因子、組織纖溶酶原等1800多種獨特的蛋白質。由于基質膠中各因子的不確定性，并且存在批次間差異，因此目前也有一些聚焦于基質膠替代方案的研究，如圖2^【3】。

Q47：怎樣確定某一種類器官的培養方式更適用于基質膠包埋法還是氣-液交互法呢？

A47：1、根據所模擬的器官自身生長情況選擇，例如：皮膚的正常生長是有一面需要接觸空氣，那么對于皮膚類器官的培養傾向于利用氣-液交互法來培養^【4】；
2、考慮所培養的類器官模型的應用方向，例如：氣-液交互法培養易于進行病毒感染實驗，因此用于病毒感染實驗的氣道類器官會優先選擇氣-液交互法培養^【5】。

Q48：在進行藥敏實驗前，類器官的接種方式是怎樣的呢？

A48：藥物篩選前，通常將類器官吹散后，用含2%-5%基質膠的培養基懸浮，并最終鋪在基質膠包被的孔板中^【6-7】。

Q49：在離心回收時，會有很多類器官粘附在離心管壁，有沒有更好的辦法提高回收率？

A49：建議采用水平轉子代替角轉子，可以有效減少類器官掛在離心管壁的情況。

Q50：利用腫瘤類器官模型進行篩選的藥物有什么局限性嗎？

A50：1、抗體藥物因為需要免疫細胞的參與，因此腫瘤類器官不能篩選抗體類藥物，此類藥物篩選需要構建腫瘤類器官-腫瘤微環境的模型來實現；
由于腫瘤類器官中沒有對血管進行培養，因此抗血管類的藥物也同樣不能進行篩選。

參考文獻

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