2025年諾貝爾生理學或醫學獎再次將目光投向了免疫調節領域，獲獎成果揭示了調節性T細胞（Regulatory T cells, Treg）在自身免疫及炎癥調控中的核心機制，調節性T細胞作為免疫系統的“剎車器”，再次受到科學界的重視。
Treg療法臨床管線
從臨床轉化來看，Treg在自身免疫、腫瘤免疫以及器官移植等方向進展較多。比如在自身免疫病治療方面：針對Treg功能缺陷，通過IL-2信號通路激活或細胞移植恢復其活性，已在類風濕關節炎、1型糖尿病臨床試驗中顯示療效，在炎性驅動小兒自閉癥疾病模型治療等方面取得新進展。在癌癥免疫療法革新方面：腫瘤微環境中過度積累的Treg會抑制抗腫瘤免疫，通過CCR8單抗等藥物靶向清除這類細胞可增強PD-1抑制劑療效，相關聯合療法響應率及患者生存期獲得提升。在器官移植排斥防護方面：輸注體外擴增的Treg可降低腎移植等排斥反應風險。但是，人源Treg療法目前尚未獲得正式批準成為上市藥物，還需要基礎理論及臨床醫藥實踐的多方面突破[1]。
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體外誘導Treg細胞關鍵因子
體外產生的Treg細胞被稱為誘導性Treg細胞（iTreg），體內天然產生的Treg細胞被稱為天然Treg細胞（nTreg)。
IL-2
通過結合CD4+T細胞表面受體IL-2R從而激活下游STAT5信號通路，STAT5激活后，促進Foxp3基因的轉錄，IL-2信號可以提高Foxp3表達的穩定性和量，防止其被下調或沉默，同時維持已分化Treg的抑制功能。
TGF-β1
Foxp3表達的關鍵啟動因子也是誘導Foxp3表達的直接信號因子。體外誘導iTreg中在TGF-β和IL-2刺激下，初始T細胞即可產生Foxp3+Treg。
體外誘導Treg細胞實驗流程[2]
PBMC分離
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1 將抗凝全血與等體積PBS輕輕混勻，以便降低血液粘稠度。 -
2 在50mL離心管中加入密度離心介質（如Ficoll）溶液（體積建議為稀釋血的1/2-1/3）。 -
3 傾斜離心管，緩慢地將稀釋血液覆蓋在密度離心介質上。 -
4 室溫條件下，1150×g離心20 min。
注意：操作時應關閉離心剎車功能，將啟動速度和停止速度降到最低
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5 取出位于密度離心介質與血漿層之間的含有PBMCs的白色環,將其轉移到一個新的50 mL離心管中。
注意：盡量減少吸取血漿和密度離心介質，不要觸碰紅色的紅細胞沉淀。
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6 用PBS補充至50 mL。在室溫條件下，450×g離心10 min。
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7 去除上清液，加入50mL RPMI培養基（含10%胎牛血清），并充分重懸。
注意：如果存在細胞團塊，通過40 µm細胞濾網過濾細胞。
nTreg分離
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1 配制分離緩沖液：在PBS中加入0.5%（w/v）人血清白蛋白和2 mM EDTA。
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2 重懸并計數PBMCs，在室溫條件下，450×g離心10 min。
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3 每1×107個PBMCs加入90 µL分離緩沖液和2 µL CD25磁珠，充分重懸混勻后在4℃孵育15 min。
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4 用PBS補充滿至30 mL。在4℃以450×g離心10 min。
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5 準備LS柱：用3 mL分離緩沖液平衡柱，丟棄流出液。
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6 將細胞重懸于3 mL分離緩沖液中。將細胞轉移到LS柱上，用新的15 mL離心管收集流出液。
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7 用3 mL分離緩沖液洗柱2次，將收集的流出液儲存在4℃以備后續步驟使用。
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8 從磁鐵上取下柱。每柱用3 mL分離緩沖液洗脫2次，收集至15 mL離心管中，得到CD25+的nTreg。
注意：如需要可過第二個柱，可進一步提高純度。
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9 在4℃以450×g離心10 min，丟棄上清。
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10 用15 mL的T細胞培養基洗滌細胞，在4℃以450×g離心10 min，丟棄上清。
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11 將細胞重懸于0.5 mL的T細胞培養基（含100 IU/mL的 IL-2）中。轉移細胞至24孔板。再用0.5 mL培養基沖洗離心管，并合并至24孔板。
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12 計數nTregs，用T細胞培養基（含100 IU/mL的IL-2）調整Treg密度至1-2×106 cells/mL。
注意：通常每個白細胞層的產率為1-4 x 106個Tregs。
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13 在37℃、5%CO2條件下孵育nTreg直至使用。
CD4+T細胞分離
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1 將nTreg耗竭的PBMCs合并至50 mL離心管中，用PBS補充滿至50 mL。
注意：nTreg耗竭的PBMCs為【nTreg分離】中步驟8-9收集的流出液，用于進行CD4?T細胞分離。
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2 在室溫下以200×g離心PBMCs 5-10 min，去除上清。用50 mL PBS重懸細胞，重復2次。
注意：PBS洗滌對于去除血小板至關重要，后續負向分離試劑盒無法去除血小板。在此低速離心條件下，血小板會留在上清液中，可在顯微鏡載玻片上監測血小板去除情況。
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3 用50 mL PBS重懸PBMCs，并進行細胞計數。
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4 在4℃以450×g離心PBMCs 10 min，去除上清，每107個細胞加入40 µl分離緩沖液，重懸細胞。
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5 每107個細胞加入10 µL初始CD4+T細胞生物素抗體混合物?；旌虾?，在4℃孵育10 min。
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6 加入40 mL冷PBS洗滌細胞，在4℃以450×g離心10 min。去除上清，每107個細胞加入80 µL分離緩沖液重懸細胞。
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7 每107個細胞加入20 µL抗生物素微磁珠。充分混合，在4℃孵育15 min。
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8 用冷PBS補充滿至50 mL，在4℃以450×g離心10 min。
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9 準備LS磁柱（用3mL 分離緩沖液進行平衡）。為避免磁柱過載，每個磁柱最多用于 2.5×108個PBMC。
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10 去除上清，用3 mL分離緩沖液重懸細胞。將細胞轉移至LS柱。收集流出液（含有初始CD4+T細胞），置于15 mL離心管中。
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11 用2 mL分離緩沖液沖洗離心管，轉移至柱上。
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12 用3 mL分離緩沖液洗柱3次，每次等待柱停止滴液后再加入新的液體。
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13 收集流出液（含初始CD4+T細胞），在4℃以450×g離心10 min。
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14 去除上清后，用15 mL T細胞培養基洗滌細胞，在室溫下以450×g離心10 min，去除上清/
注意：分離緩沖液含有EDTA，會螯合鈣離子，從而影響T細胞激活。在進行任何刺激實驗之前，需完全移除分離緩沖液，并用15 mL培養基洗滌細胞2次。
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15 用T細胞培養基重懸細胞，調整密度至2-3×106cells/mL。在適當的培養瓶或孔板中于培養箱內過夜靜置細胞。
iTreg細胞誘導培養
誘導培養基的準備
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1 準備并預熱T細胞培養基，需補充2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
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2 準備細胞因子、激活抗體和化合物的儲備濃度：
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3 在T細胞培養基中配制4倍濃度的預混液（每孔50 µL）。
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4 前一天，在96孔U型培養板中，每孔加入65 µl含5 µg/mL抗CD3抗體的PBS溶液。用鋁箔包裹培養板，在4℃過夜孵育。
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5 培養當天，移除孔中的抗CD3抗體溶液。每孔加入200 µL PBS，洗滌2次后備用。
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6 往孔中加入50 µL的抗CD28抗體和IL-2預混液，50 µL 的TGF-β1預混液，50 µL的ATRA預混液。
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7 用200 µl PBS填充所有空孔，包括邊緣孔。將培養板在37℃、5%CO2條件下預熱。
初始CD4+ T細胞接種培養
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1 將細胞密度調整密度至2.2-2.6×106cells/mL。
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2 將細胞加入準備好的刺激培養板，每孔50 µL細胞（110,000-130,000細胞/孔）。每個孔的總體積現應為200 µL。
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3 將培養板放入37℃、5%CO2培養箱培養。
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4 從第2至3天起，應可見增殖細胞的小簇，隨著時間推移，這些小簇會聚集成更大的簇。
iTreg表型分析
qRT-PCR法
提取RNA對Foxp3和一個管家基因（如RPL13A）進行qRT-PCR。同時檢測其他Treg標志基因的表達，例如“Treg上調基因”IL2RA、CTLA4、IKZF4，以及“Treg下調”基因IFNG、SATB1。
流式細胞術
通過流式細胞術篩選出CD4+CD25+Foxp3+Treg。
Treg細胞的流式表型[2]
Treg相關產品推薦
近岸蛋白提供T細胞體外激活培養以及Treg細胞分化的所需的抗體、人源和鼠源細胞因子，包括IL-2、TGF-β1、抗CD3抗體、抗CD28抗體等，并能提供批間穩定一致的GMP級產品，支持臨床無縫過渡轉化。
國際標準品測活
高批間一致性
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參考文獻
[1]Xuemei Tong ,Bin Li From “Immune Homeostasis” to “Immune Perturbation”- Insights and Perspectives on the 2025 Nobel Prize in Physiology or Medicine[J].中國科學基金,2025,39(4)