近年來，隨著全球各大藥企在新藥研發中持續投入，大量新藥進入臨床階段，多家國內外的制藥企業將更多的資源投入技術研發，致力于實現關鍵性突破，打造具有差異化的管線。
差異化管線布局關鍵在于靶點選擇，人類蛋白質組中具有藥物開發的潛在靶標約有6000多種為膜蛋白。其中結構復雜的多次跨膜蛋白(Multipass transmembrane protein)包括GPCRs、離子通道和轉運蛋白等。這些完整結構的多次跨膜蛋白具有重要的功能，從運輸到信號轉導與諸多疾病的發生緊密相關。在小分子的上市藥物中，有超過50%的靶點為多次跨膜蛋白；市面上大部分作用于多次跨膜蛋白的現有藥物都有各自的不足，例如同族多次跨膜蛋白中的配體結合口袋相對相似，藥物缺乏較好的特異性；亦或是它們參與許多不同的信號通路而產生的不良影響，這些信號通路（離子通道和轉運體）可能對整體細胞平衡條件產生強烈影響。這些不足會導致藥物安全性堪憂、副作用過強。多次跨膜蛋白靶點相關的疾病需開發針對特定構象或信號通路的治療方法，獲得具有更高親和力、特異性的藥物，單克隆抗體(mAb)靶向多次跨膜蛋白是實現靶向選擇的一種有效方法。
在過去生物藥研發歷程中，多次跨膜靶點大多數被定義為難成藥或不可成藥的靶點，猶如“高嶺之花”觸不可及。近年來隨著對多次跨膜蛋白認知的逐步深入及技術的迭代更新，更多的靶點開始褪去神秘的面紗，逐漸走入行業的視野。由于存在多個跨膜結構域(TMDs)，這可能導致表達和純化過程中的不穩定性和聚集，多次跨膜蛋白靶向藥物開發最大的挑戰在于其構象的復雜程度。對于靶向藥物研發而言，獲取保持天然構象與活性的靶蛋白是至關重要的環節，因此，迫切需要創新技術來突破多次跨膜蛋白靶點面臨的“抗體開發難題”。
圖1. 多次跨膜蛋白的經典結構[1]
“抗體開發難題”，我們能做什么？
近岸蛋白自主研發3000+藥物靶蛋白，覆蓋多個疾病領域，擁有550個物種超過24000個重組蛋白開發經驗，產品類型豐富，涵蓋多種屬、多標簽、生物素化以及特定位點突變體蛋白等，應用于動物免疫、抗體藥物篩選評估、質量放行等藥物研發環節。
在過去的幾年內，近岸蛋白對多次跨膜靶點進行深度開發，持續強化，新增了多個多次跨膜靶點產品，公司的多次跨膜蛋白等困難靶點開發技術，解決了跨膜蛋白表達量低、穩定性差、溶解度低及難純化等難題，產品類型多樣，開發技術包含類病毒粒子（VLP）、去垢劑及mRNA等形式。
NovoiSMART®技術平臺
NovoiSMART®(Novo Immunize and Screen antibody of Multipass trAnsmembRane proTein）是由近岸蛋白基于豐富的蛋白質和抗體開發經驗，針對結構復雜的多次跨膜蛋白抗體開發難的現狀，推出的綜合性的技術平臺，可提供多次跨膜靶點抗體開發整體解決方案。NovoiSMART®技術平臺結合多策略抗體發現技術、人源化親和力成熟等技術，已完成120多個靶標抗體藥物候選分子篩選及驗證，其中多個候選分子已完成商業轉讓。NovoiSMART®技術平臺能夠滿足復雜靶點及各類藥物開發的不同需求。
案例
一、GPRC5D表位多樣性抗體篩選
GPRC5D即G蛋白偶聯受體C組5成員D（G protein-coupled receptor, class C, group 5, member D），它是G蛋白偶聯受體（GPCRs）家族的成員之一。
圖2.GPRC5D結構[2]
GPRC5D在細胞膜表面穩定表達、不會脫落，且在除毛囊以外的正常細胞中不表達，僅在多發性骨髓瘤細胞中顯著上升表達。由于MM遺傳和表型的異質性，每一種抗原都不是由MM細胞或漿細胞直接表達的，靶點脫落和抗原丟失是引起腫瘤逃逸和MM復發難治的重要原因。靶向GPRC5D的免疫療法可以抑制腫瘤逃逸，它的表達不受 BCMA丟失的影響，因此使用這種治療性抗體可以治療抗BCMA療法治療失敗或BCMA低表達或不表達的患者。
GPRC5D具有4個胞外結構域（ECD），篩選結合不同抗原結構域和不同抗原表位的抗體并開發成藥，可以有效的避免抗原丟失或者突變引起的藥效降低或者耐藥，增強藥物的長期持久性嚴守MM最后一道治療防線。近岸蛋白通過NovoiSMART®技術平臺，對篩選獲得的候選分子進一步進行表位檢測。使用GPRC5A的胞外序列對GPRC5D的4個胞外結構域 ECD進行突變替換，并命名1-4（對應圖2結構的Loop1-4的替換）。結果如圖3和圖4顯示，成功篩選出表位多樣的GPRC5D候選分子。基于此類，對于部分耐藥靶標，NovoiSMART®技術平臺可以為您提供更優的選擇！
圖3.流式檢測相較野生型的MFI下降比例熱圖
圖4.GPRC5D抗體表位多樣性統計
二、CLDN6高特異性抗體篩選
Claudin6 (CLDN6) 是一個四次跨膜蛋白，具有一個短的細胞質N端和一個C端細胞質結構域，兩個胞外結構域(ECL1較大，ECL2較小)，以及一個短的胞內環。ECL1和羧基末端的PDZ結合基序( PBM )是CLDNs的典型結構域。
圖5.CLDN6結構圖[3]
CLDN6和同家族的CLDN9具有高度同源性，其胞外區的氨基酸序列只有三處不同。但二者的表達卻并非完全相同，CLDN6在卵巢癌、子宮肉瘤和睪丸癌中高表達，在其它組織中表達極低。同家族的CLDN9在卵巢癌、膽管癌、睪丸癌等癌癥中高表達，但在其它組織中也有不同程度的表達。在藥物開發中，對家族龐大的靶蛋白來說，不同的適應癥涉及不同的靶點設計及藥物類型，其所需要的特異性要求也不同。近岸蛋白通過NovoiSMART®技術平臺，針對CLDN6和CLDN9分別進行免疫篩選，結果如圖6所示，CLDN6候選分子與CLDN6陽性細胞特異性結合，與CLDN9陽性細胞基本無非特異性結合；圖7的CLDN9候選分子也顯示出與CLDN9陽性細胞的特異性結合，與CLDN6陽性細胞基本無非特異結合。盡管CLDN6和CLDN9序列與結構高度相似，但NovoiSMART®技術平臺可以精準篩選出具有高度特異性與功能活性的候選分子。對于諸多家族蛋白眾多，且同源性較高的藥物靶標開發，NovoiSMART®技術平臺可以更快速精準地為您保駕護航！
圖6. 抗體特異性結合CLDN6陽性細胞
圖7. 抗體特異性結合CLDN9陽性細胞
近岸蛋白已開發多次跨膜靶點（部分）展示
| 靶點名稱 | 靶點描述 |
| GPRC5D | GPCR家族，七次跨膜蛋白, 可用于多發性骨髓瘤治療 |
| Claudin 18.2 | 四次跨膜蛋白，與Claudin 18.1同源性高，可用于胃癌、食道癌、胰腺癌等疾病治療 |
| Claudin 6 | 四次跨膜蛋白，與Claudin 9同源性高，可用于卵巢癌、子宮內膜癌等多種疾病治療 |
| NaPi2b | 離子通道蛋白，八次跨膜蛋白，可用于非小細胞肺癌、卵巢癌等疾病治療 |
| CCR7 | GPCR家族，七次跨膜蛋白, 可用于非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病等疾病治療 |
| SCN9A | 離子通道蛋白，二十四次跨膜蛋白，可用于慢性疼痛、神經痛、骨關節炎等疾病治療 |
參考文獻
[1] Gulezian E, Crivello C, Bednenko J, Zafra C, Zhang Y, Colussi P, Hussain S. Membrane protein production and formulation for drug discovery. Trends Pharmacol Sci. 2021 Aug;42(8):657-674. doi: 10.1016/j.tips.2021.05.006. PMID: 34270922.
[2] Rodriguez-Otero P, van de Donk NWCJ, Pillarisetti K, Cornax I, Vishwamitra D, Gray K, Hilder B, Tolbert J, Renaud T, Masterson T, Heuck C, Kane C, Verona R, Moreau P, Bahlis N, Chari A. GPRC5D as a novel target for the treatment of multiple myeloma: a narrative review. Blood Cancer J. 2024 Feb 2;14(1):24. doi: 10.1038/s41408-023-00966-9. Erratum in: Blood Cancer J. 2024 Mar 6;14(1):40. doi: 10.1038/s41408-024-01018-6. PMID: 38307865; PMCID: PMC10837198.
[3] Qu H, Jin Q, Quan C. CLDN6: From Traditional Barrier Function to Emerging Roles in Cancers. Int J Mol Sci. 2021 Dec 14;22(24):13416. doi: 10.3390/ijms222413416. PMID: 34948213; PMCID: PMC8705207.