研究團隊收集了40例sALS患者的血液樣本，發現50%的患者存在mtDNA突變（如COXI基因6692A缺失），導致CIV關鍵亞基翻譯提前終止。此外，對29例sALS患者的肌肉活檢發現，部分患者肌肉中存在COX缺陷纖維，且運動神經元（MN）中CIV亞基表達顯著降低。通過將329名ALS患者運動神經元的RNA測序（RNA-seq）數據與他們的生存時間進行比較發現，CIV低表達的ALS患者生存期更短。

利用線粒體基因組編輯技術（DdCBE），研究團隊在大鼠神經元中特異性敲除CIV亞基（COXII/III），成功構建了首個模擬sALS的動物模型。這些大鼠逐漸出現體重減輕、骨骼肌萎縮、后凸和癱瘓等ALS樣表型。

研究人員對出生后3周、1個月和2個月的COXIIINeuN-Cre大鼠與COXIIILSL對照組之間進行了多項運動行為測試，這些大鼠出現漸進性運動缺陷的發展類似于人類ALS癥狀的進展。因此，CIV的神經元缺陷導致大鼠出現多種類似ALS的表型。

3. CIV缺陷大鼠的選擇性MN丟失

鑒于嚴重的后肢運動缺陷是經典ALS表型特征，研究團隊對CIV缺陷大鼠腰椎脊髓α運動神經元特異性減少，而γ運動神經元未受影響。同時，通過免疫熒光染色可以觀察到運動神經元（αMNs）的顯著減少，而其他類型的神經元則相對正常。這些數據表明，在這些神經元CIV受損的大鼠中，即使在不同亞型的運動神經元之間也存在選擇性易損性。

4. 去神經支配和骨骼肌萎縮

ALS的另一個標志是肌肉萎縮，研究者評估了模型大鼠的脛前肌和腓腸肌。在疾病晚期，模型大鼠的脛前肌和腓腸肌的重量明顯低于其野生型（WT）對照。通過Wheat Germ Agglutinin（WGA）染色可以觀察到肌肉纖維的萎縮，肌纖維的平均截面積顯著減小。

此外，神經肌肉接頭（NMJ）的完整性受損，表現為神經末梢與肌纖維的連接減少。研究者進一步對脛前肌的神經肌肉接點（NMJ）進行了深入分析，該肌肉主要由腰椎脊髓中的α運動神經元支配的快縮肌纖維組成，這在人體中對肌萎縮側索硬化癥（ALS）特別敏感。在對CIV損傷的反應中，NMJ的衰弱表現得非常明顯，NF和突觸素2信號都明顯減少。對腓腸肌的電生理記錄顯示，由坐骨神經引起的復合肌肉動作電位（CMAP）振幅明顯下降。這些數據表明在CIV缺陷模型中NMJ的完整性受到損害，這種情況通常出現在ALS患者中。

5. 神經炎癥升高和細胞死亡

為了闡明觀察到的CIV缺陷大鼠中MN損失的機制，研究者對COXIII-LSL與COXIII-NeuN-Cre大鼠的腰脊髓前角進行了單細胞核RNA測序(snRNA-seq)和基因集富集分析（GSEA）。snRNA-seq揭示，小膠質細胞介導的神經炎癥和GSDME依賴性細胞壞死是MN丟失的關鍵驅動因素。差異表達基因（DEGs）主要與四個通路相關，包括神經炎癥反應、鈣離子跨膜運輸、神經元凋亡過程和與其他神經細胞比較下的α運動神經元突觸可塑性。值得注意的是，被鑒定為脊髓損傷的神經元特異性生物標志物的ATF3在α運動神經元中也被顯著激活，涉及髓鞘抑制和反射遲鈍的基因也均被激活。神經元CIV缺乏導致約70%的運動神經元在出生后第6周出現TDP-43細胞質錯誤定位，伴隨有ATP生產減少。此外，誘導細胞壞死的GSDME基因（編碼Gasdermin E蛋白）也被激活。這些數據表明，大鼠模型重現了ALS患者的許多關鍵特征。