在視網膜類器官內建立穩定、長期存在的血管系統十分困難，這主要是由于血管內皮細胞（ECs）和神經細胞（視網膜細胞）的培養方案互不兼容：內皮細胞的管腔結構和活性要求添加高濃度的血管內皮生長因子（VEGF）和專用的內皮培養基（如EGM-2）。然而，這種培養基環境對視網膜神經元的成熟是有害的，長期高濃度的VEGF甚至會導致視網膜組織的病理變化。

因此，該研究明確提出“瞬時血管支持”的概念。試圖通過讓內皮細胞在早期形成一段時間的血管樣網絡，幫類器官核心區緩解缺氧與凋亡壓力，從而顯著提升RGC的長期存活率并促進其功能成熟。

具體而言，他們利用轉錄因子ETV2.2誘導人誘導多能干細胞（hiPSCs）定向分化為內皮細胞（ECs），并在第7天胚狀體成型后，再置于預分化好的內皮細胞單層上，從而成功誘導內皮細胞遷移并整合入類器官內部，形成PECAM1陽性的血管樣網絡。這些結構在形態上具備管腔特征，但并不等同于成熟血管，其存在時間隨類器官發育逐步縮短。

實驗觀察到，這些內皮細胞在類器官內表現出極高的組織能力。在第4至8周，PECAM1陽性的細胞形成了典型的血管樣分支結構，隨后在第10周達到約74.22 ± 5.85 μm的平均長度，隨后長度與面積逐漸下降，在第22周仍可檢測到殘留信號。這一動態變化本身提示，該系統并非依賴持續血管灌流維持組織，而是在關鍵發育窗口內降低缺氧與細胞凋亡壓力?；铙w缺氧成像也證實，血管化類器官（vROs）內部的缺氧程度顯著降低。

最后，隨著培養進入中后期（約12周后），為了讓視網膜的光感受器和雙極細胞順利成熟，研究者必須切換回神經系統專用的成熟培養基。由于缺乏持續的血管營養因子支持，這些已經形成的微血管網會逐漸退化。這種“瞬時血管化”的設計其實是一種精妙的平衡：在類器官發育最快、對氧氣最渴求的早期階段（即內部最容易因缺氧而導致RGCs凋亡的階段），提供血管支持來“救命”；等RGCs度過了最脆弱的時期并建立起初步結構后，再撤掉血管支持，讓神經回路在純凈的神經環境中發育。

圖：將內皮細胞（ECs）與視網膜類器官（ROs）進行整合

vROs的直徑在各個觀察節點均顯著大于對照組，并在第12周左右達到峰值。且該差異并非由類器官融合率增加導致。

圖：血管化特征的表征，及其對類器官的影響

更重要的是，血管化顯著降低了早期凋亡水平，從而推遲了視網膜神經節細胞的消失時間。流式細胞術檢測顯示，從第12周起，vROs中的Annexin V陽性早期凋亡細胞比例大幅下降。這一差異在第17周和第26周尤為明顯，提示血管樣結構在延緩發育中后期細胞死亡方面發揮作用。在第18周的統計中，vROs中的POU4F1陽性RGCs比例竟然維持在18.2% ± 4.31%，相較于對照組的1%左右，存活率提升了近二十倍。

圖：vRO 中的 RGC 存活率增強

單細胞與單核RNA測序則顯示，血管化類器官中額外富集了一類占比約4.2%的血管相關細胞群，對照組僅為0.7%，且該細胞群比例與神經節細胞比例呈顯著正相關（Spearman r = 0.89，p = 0.007），指向血管相關微環境與神經節細胞長期存活之間的直接關聯。

僅僅依靠血管化解決營養供應并不足以構成有效模型。研究者推測，RGCs在類器官中的退化可能也與其軸突無法定向生長、缺乏靶標連接有關。

為此，他們設計了一個巧妙的集成平臺：將血管化類器官置入帶有微流控裝置的多電極陣列（MEA）芯片中。該裝置通過PDMS微通道引導RGC軸突從類器官中向外延伸，模擬了體內視神經纖維層的定向排列，為軸突提供了機械張力和結構支撐。此外還通過與微電極直接接觸，實現了無損、長期的電生理記錄。

結果發現，在微流控的“導航”和血管化的“補給”雙重加持下，RGCs不僅活了下來，還實現了功能上的飛躍。單細胞測序預測顯示，vROs中處于“命運確定”狀態的成熟RGC比例達到52%，遠高于對照組的36%。電生理記錄證實，這些RGCs不僅表現出穩定的自發放電，更在第20周后表現出持久的神經網絡活動，而此時的對照組類器官通常已經失去了功能信號。

圖：RO中自發和光遺傳誘發的 RGC 活動

這項研究最令人振奮的成果在于，這些培養超過30周的血管化類器官展現出了由光感受器驅動的復雜回路電活動。通過光刺激，研究人員在RGC水平上檢測到了經典的ON、OFF以及ON-OFF型反應。其中，ON-OFF神經元在470 nm和580 nm光脈沖下表現出最強的響應，峰值頻率分別超過237 Hz和281 Hz。三類神經元的反應延遲分別集中在20–36 ms、130–187 ms以及中間區間，構成典型的功能分化譜系。

這種具有時序差異和功能分化的信號傳遞，證明了類器官內部已經建立了從光感受器到雙極細胞再到RGCs的垂直功能回路。這是目前體外視網膜模型所能達到的最高功能化水平之一。且ON與ON-OFF型神經元在超過90%的光脈沖中產生穩定響應，而OFF型神經元的響應比例分別為72%和53%，高度符合體內視網膜生理特征。

圖：PR驅動的光響應

除了優化模型，研究團隊還展示了血管化類器官在模擬人類疾病方面的巨大潛力。他們通過降低氧濃度（4% O2）并添加血管內皮生長因子（VEGF），在類器官中成功模擬了早產兒視網膜病變（ROP）的核心病理特征：病理性新生血管生成。

在誘導缺氧的條件下，vROs展現出顯著的血管重塑，PECAM1和vWF等血管標記物的mRNA表達量大幅上調。這種模型為研究缺氧如何驅動異常血管增生，以及篩選針對ROP或其他增殖性視網膜病變的藥物提供了極其寶貴的類人平臺。

圖：缺氧誘導的vROs心血管形成模擬了ROP病理特征

總的來說，這項研究通過“瞬時血管化”與“軸突引導”的生物工程組合拳，不僅延長了類器官中RGCs的保鮮期，更將其功能成熟推向了新的高度。它告訴我們，類器官研究正在從單純的細胞自組織向復雜的系統集成演進。未來，通過進一步完善流體動力學模擬和神經靶標整合，這種“血管化”的類器官有望成為精準醫學和再生醫學中不可或缺的實驗基石。