在視網(wǎng)膜類器官內(nèi)建立穩(wěn)定、長(zhǎng)期存在的血管系統(tǒng)十分困難，這主要是由于血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）和神經(jīng)細(xì)胞（視網(wǎng)膜細(xì)胞）的培養(yǎng)方案互不兼容：內(nèi)皮細(xì)胞的管腔結(jié)構(gòu)和活性要求添加高濃度的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和專用的內(nèi)皮培養(yǎng)基（如EGM-2）。然而，這種培養(yǎng)基環(huán)境對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元的成熟是有害的，長(zhǎng)期高濃度的VEGF甚至?xí)?dǎo)致視網(wǎng)膜組織的病理變化。

因此，該研究明確提出“瞬時(shí)血管支持”的概念。試圖通過讓內(nèi)皮細(xì)胞在早期形成一段時(shí)間的血管樣網(wǎng)絡(luò)，幫類器官核心區(qū)緩解缺氧與凋亡壓力，從而顯著提升RGC的長(zhǎng)期存活率并促進(jìn)其功能成熟。

具體而言，他們利用轉(zhuǎn)錄因子ETV2.2誘導(dǎo)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSCs）定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞（ECs），并在第7天胚狀體成型后，再置于預(yù)分化好的內(nèi)皮細(xì)胞單層上，從而成功誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移并整合入類器官內(nèi)部，形成PECAM1陽性的血管樣網(wǎng)絡(luò)。這些結(jié)構(gòu)在形態(tài)上具備管腔特征，但并不等同于成熟血管，其存在時(shí)間隨類器官發(fā)育逐步縮短。

實(shí)驗(yàn)觀察到，這些內(nèi)皮細(xì)胞在類器官內(nèi)表現(xiàn)出極高的組織能力。在第4至8周，PECAM1陽性的細(xì)胞形成了典型的血管樣分支結(jié)構(gòu)，隨后在第10周達(dá)到約74.22 ± 5.85 μm的平均長(zhǎng)度，隨后長(zhǎng)度與面積逐漸下降，在第22周仍可檢測(cè)到殘留信號(hào)。這一動(dòng)態(tài)變化本身提示，該系統(tǒng)并非依賴持續(xù)血管灌流維持組織，而是在關(guān)鍵發(fā)育窗口內(nèi)降低缺氧與細(xì)胞凋亡壓力。活體缺氧成像也證實(shí)，血管化類器官（vROs）內(nèi)部的缺氧程度顯著降低。

最后，隨著培養(yǎng)進(jìn)入中后期（約12周后），為了讓視網(wǎng)膜的光感受器和雙極細(xì)胞順利成熟，研究者必須切換回神經(jīng)系統(tǒng)專用的成熟培養(yǎng)基。由于缺乏持續(xù)的血管營(yíng)養(yǎng)因子支持，這些已經(jīng)形成的微血管網(wǎng)會(huì)逐漸退化。這種“瞬時(shí)血管化”的設(shè)計(jì)其實(shí)是一種精妙的平衡：在類器官發(fā)育最快、對(duì)氧氣最渴求的早期階段（即內(nèi)部最容易因缺氧而導(dǎo)致RGCs凋亡的階段），提供血管支持來“救命”；等RGCs度過了最脆弱的時(shí)期并建立起初步結(jié)構(gòu)后，再撤掉血管支持，讓神經(jīng)回路在純凈的神經(jīng)環(huán)境中發(fā)育。

圖：將內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）與視網(wǎng)膜類器官（ROs）進(jìn)行整合

vROs的直徑在各個(gè)觀察節(jié)點(diǎn)均顯著大于對(duì)照組，并在第12周左右達(dá)到峰值。且該差異并非由類器官融合率增加導(dǎo)致。

圖：血管化特征的表征，及其對(duì)類器官的影響

更重要的是，血管化顯著降低了早期凋亡水平，從而推遲了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的消失時(shí)間。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，從第12周起，vROs中的Annexin V陽性早期凋亡細(xì)胞比例大幅下降。這一差異在第17周和第26周尤為明顯，提示血管樣結(jié)構(gòu)在延緩發(fā)育中后期細(xì)胞死亡方面發(fā)揮作用。在第18周的統(tǒng)計(jì)中，vROs中的POU4F1陽性RGCs比例竟然維持在18.2% ± 4.31%，相較于對(duì)照組的1%左右，存活率提升了近二十倍。

圖：vRO 中的 RGC 存活率增強(qiáng)

單細(xì)胞與單核RNA測(cè)序則顯示，血管化類器官中額外富集了一類占比約4.2%的血管相關(guān)細(xì)胞群，對(duì)照組僅為0.7%，且該細(xì)胞群比例與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞比例呈顯著正相關(guān)（Spearman r = 0.89，p = 0.007），指向血管相關(guān)微環(huán)境與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞長(zhǎng)期存活之間的直接關(guān)聯(lián)。

僅僅依靠血管化解決營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)并不足以構(gòu)成有效模型。研究者推測(cè)，RGCs在類器官中的退化可能也與其軸突無法定向生長(zhǎng)、缺乏靶標(biāo)連接有關(guān)。

為此，他們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)巧妙的集成平臺(tái)：將血管化類器官置入帶有微流控裝置的多電極陣列（MEA）芯片中。該裝置通過PDMS微通道引導(dǎo)RGC軸突從類器官中向外延伸，模擬了體內(nèi)視神經(jīng)纖維層的定向排列，為軸突提供了機(jī)械張力和結(jié)構(gòu)支撐。此外還通過與微電極直接接觸，實(shí)現(xiàn)了無損、長(zhǎng)期的電生理記錄。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在微流控的“導(dǎo)航”和血管化的“補(bǔ)給”雙重加持下，RGCs不僅活了下來，還實(shí)現(xiàn)了功能上的飛躍。單細(xì)胞測(cè)序預(yù)測(cè)顯示，vROs中處于“命運(yùn)確定”狀態(tài)的成熟RGC比例達(dá)到52%，遠(yuǎn)高于對(duì)照組的36%。電生理記錄證實(shí)，這些RGCs不僅表現(xiàn)出穩(wěn)定的自發(fā)放電，更在第20周后表現(xiàn)出持久的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)，而此時(shí)的對(duì)照組類器官通常已經(jīng)失去了功能信號(hào)。

圖：RO中自發(fā)和光遺傳誘發(fā)的 RGC 活動(dòng)

這項(xiàng)研究最令人振奮的成果在于，這些培養(yǎng)超過30周的血管化類器官展現(xiàn)出了由光感受器驅(qū)動(dòng)的復(fù)雜回路電活動(dòng)。通過光刺激，研究人員在RGC水平上檢測(cè)到了經(jīng)典的ON、OFF以及ON-OFF型反應(yīng)。其中，ON-OFF神經(jīng)元在470 nm和580 nm光脈沖下表現(xiàn)出最強(qiáng)的響應(yīng)，峰值頻率分別超過237 Hz和281 Hz。三類神經(jīng)元的反應(yīng)延遲分別集中在20–36 ms、130–187 ms以及中間區(qū)間，構(gòu)成典型的功能分化譜系。

這種具有時(shí)序差異和功能分化的信號(hào)傳遞，證明了類器官內(nèi)部已經(jīng)建立了從光感受器到雙極細(xì)胞再到RGCs的垂直功能回路。這是目前體外視網(wǎng)膜模型所能達(dá)到的最高功能化水平之一。且ON與ON-OFF型神經(jīng)元在超過90%的光脈沖中產(chǎn)生穩(wěn)定響應(yīng)，而OFF型神經(jīng)元的響應(yīng)比例分別為72%和53%，高度符合體內(nèi)視網(wǎng)膜生理特征。

圖：PR驅(qū)動(dòng)的光響應(yīng)

除了優(yōu)化模型，研究團(tuán)隊(duì)還展示了血管化類器官在模擬人類疾病方面的巨大潛力。他們通過降低氧濃度（4% O2）并添加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），在類器官中成功模擬了早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變（ROP）的核心病理特征：病理性新生血管生成。

在誘導(dǎo)缺氧的條件下，vROs展現(xiàn)出顯著的血管重塑，PECAM1和vWF等血管標(biāo)記物的mRNA表達(dá)量大幅上調(diào)。這種模型為研究缺氧如何驅(qū)動(dòng)異常血管增生，以及篩選針對(duì)ROP或其他增殖性視網(wǎng)膜病變的藥物提供了極其寶貴的類人平臺(tái)。

圖：缺氧誘導(dǎo)的vROs心血管形成模擬了ROP病理特征

總的來說，這項(xiàng)研究通過“瞬時(shí)血管化”與“軸突引導(dǎo)”的生物工程組合拳，不僅延長(zhǎng)了類器官中RGCs的保鮮期，更將其功能成熟推向了新的高度。它告訴我們，類器官研究正在從單純的細(xì)胞自組織向復(fù)雜的系統(tǒng)集成演進(jìn)。未來，通過進(jìn)一步完善流體動(dòng)力學(xué)模擬和神經(jīng)靶標(biāo)整合，這種“血管化”的類器官有望成為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和再生醫(yī)學(xué)中不可或缺的實(shí)驗(yàn)基石。