巨噬細胞存在于每個組織中，在組織穩態以及協調免疫系統對病原體和組織損傷的反應中發揮重要作用。巨噬細胞是極其多樣化的，具有不同的個體發育，組織特異性表型，以及在炎癥和修復中的不同功能。雖然最初被認為來源于血液單核細胞，但現在已知一些組織特異性的駐留巨噬細胞，例如小膠質細胞、Kupffer細胞、肺泡巨噬細胞和Langerhans細胞是胚胎來源的，并在一生中自我補充。最近的研究表明，許多器官中存在額外的組織巨噬細胞，這些巨噬細胞可大致分為2個或3個不同的亞群。雖然不同組織巨噬細胞亞群的確切功能尚不完全清楚，但它們與促進組織炎癥、組織修復和組織纖維化等異常反應有關。在肺內，經典的組織定居巨噬細胞為肺泡巨噬細胞，定居于肺泡腔內。在肺實質內，可以在血管系統和大氣道附近以及肺泡壁的間質中發現一種額外的組織巨噬細胞，稱為間質巨噬細胞( Interstitial macrophage，IM )，IM可以分為兩個或三個亞群，Notch通路在包括髓系細胞在內的許多系統的細胞分化中起著至關重要的作用。Notch受體有4種，Notch1-4，分別與5種不同的配體Jag1，2，Dll1，3，4相互作用。在髓系細胞中，已知Notch2信號對Esam + 2型傳統樹突狀細胞( c DC2 )的發育和Ly6Chi經典單核細胞向巡游單核細胞的轉化至關重要。在脾臟和心臟中，這種轉換也抑制了單核細胞向組織的募集和隨后的巨噬細胞分化。

scRNAseq ，CITE-Seq

1. 抑制Notch2可增加肺間質巨噬細胞的數量

Notch2是肺內杯狀細胞轉分化和炎性ILC2s形成所必需的。為了證實IMs的擴增是細胞固有的，而不是繼發于其他細胞中的Notch2信號，我們產生了骨髓嵌合體，允許在造血或非造血隔室(圖1e , f)中誘導Notch2的缺失。只有在骨髓供體細胞中敲除Notch2時，Notch2的缺失才會增加IMs的數量，提示Notch2對IMs的影響是造血室固有的(圖1e )。為了證實Notch2阻斷的效應是巨噬細胞譜系固有的，我們評估了混合骨髓嵌合體中的IM數量。將WT小鼠的骨髓與對照小鼠的骨髓按1：1的比例混合，同系標記用于追蹤髓系細胞的起源(圖1g )。處理后只有Notch2缺失的骨髓來源的IMs在肺中的數量增加(圖1g )。因此，Notch2阻斷內在地作用于單核/巨噬細胞譜系細胞，以擴大肺中的IM數量。

2. 單細胞分析IMs在穩定狀態和Notch2阻斷后的情況

進行聚類分析以識別不同的亞群，揭示了4個單核細胞簇( M1、M2、M3、M4)，3個AM簇( A1、A2、A3)和4個IM簇( I1、I2、I3、I4) (圖2a )。簇M4，A2和I4主要存在于α Notch2處理的小鼠中，而M2僅存在于對照抗體處理的小鼠(圖2a , b)中。有趣的是，M4群體位于單核細胞和突現簇I4之間的UMAP，表明M4可能代表中間群體(圖2a )。Notch2阻斷也誘導AMs表型由A1型向A2型轉變。A2型AMs的特征是AM身份關鍵標記基因Car4表達量較高，為32，但RNA和抗體標記(圖2c ,補充圖2f)的AM標記Siglec F水平相似。在兩種條件下都存在的較小種群A3被鑒定為增殖型AMs (圖2c ,附圖2e)。最后，對照組小鼠中幾乎所有的IMs分離成I1，I2和I3簇。Cluster I1表達Lyve1、Folr2、Mrc1、CD163和CD209f (圖2c )。與此相反，IP α Notch2處理的動物中超過80 %的IMs由cluster ( I4 ) (圖2a , b)表示。該群體表達一些選擇性激活相關基因，如Arg1和Chil3，以及Spp1，Fabp5，Gpnmb，S100a6和多個組織蛋白酶( Ctsb、Ctsd、Ctsk、Ctss) (圖2c )。有趣的是，A2和M4群體也表達了一些標記，但程度較輕。這些基因均未在穩態IMs (附圖2e)中高表達。

3. 單核源性的α Notch2擴大間質巨噬細胞數量

通過阻斷Notch2誘導M4群，并將其定位在單核細胞和IMs之間的UMAP中，提示I4群來源于單核細胞。M4細胞通過我們的FACS和使用Immgen數據庫均被鑒定為單核細胞，但沒有用用于標記血管內細胞的α CD45 - APC抗體進行標記(圖3a )。在對照小鼠中，我們沒有鑒定出三種主要細胞類型( IM、AM、單核細胞,圖3b ,附圖3b)之間的任何細胞轉換，這表明AMs和IMs是相對穩定的群體，單核細胞的任何潛在替代是一個罕見和/或緩慢的過程。然而，在Notch2阻斷后，我們很容易識別單核細胞和擴增的α Notch2衍生的IM cluster I4之間的細胞轉換，而不是從AMs (圖3b )。

4. 局部阻斷Notch2可誘導具有肺泡巨噬細胞樣表型的I4型巨噬細胞

為了區分外周阻斷Notch2對骨髓造血和肺內細胞的影響，我們在第0天和第7天通過被動氣管內吸入( IT )直接將抗體注入氣道，并在第14天使用sc RNAseq 評估肺巨噬細胞。在對照IT處理的小鼠中，我們檢測到I4巨噬細胞數量的適度增加，這可能反映了對液體應用于肺的反應。相反，用α Notch2抗體IT處理增加了IMs的總數，大多數細胞表達相同的I4標記基因( Spp1、Gpnmb、Fabp5、Cd9和Arg1)(圖4a - c )，為了更好地了解組成I4群體的特征，我們使用基于圖的方法Hotspot37分析了特定的I4轉錄程序，該方法基于局部自相關和鄰近細胞之間的共表達將基因組織成模塊。為此，如前所述，將兩個數據集( IT、IP)整合在一起，并使用IT / IP Notch2阻斷的聯合數據集(圖5a - c )進行熱點分析。這使得我們能夠評估一個簇內基因表達的動態變化，并捕獲不會自然分離到不同子簇的基因表達梯度。通過AM標記基因Ear2，Plet1，Wfdc21和Ltc4s的表達來定義模塊I4d (圖5a )。I4d信號在AMs ( A1-A3 )中最高，但也存在于IT誘導的I4細胞中，而不是IP阻斷劑(圖5b , c )誘導的I4細胞。事實上，更多的AM特異性模塊I4d僅在與A2 AMs聚類最近的" AM-like " I4巨噬細胞中表達，進一步表明在IT而不是IP處理的小鼠(圖5c)中AMs和I4巨噬細胞之間的潛在關系。

5. 在器官損傷模型中，抗Notch2誘導的IMs類似于巨噬細胞狀態

從器官損傷數據集中對穩態IMs以及各自的未處理對照進行分類，結果表明這些研究中的絕大多數細胞可以被注釋為屬于簇I1，I2和I3。一小部分細胞可以歸類為I4，這表明I4巨噬細胞是穩定狀態(圖6a , b和圖2b)中一個真實但罕見的群體。組織損傷的公開數據集來自7個不同的研究，主要集中在不同的器官：肝臟41個，脂肪組織38個，骨骼肌42個，心臟43個，肺27個，44個，45個。在高脂飲食喂養的小鼠的附睪脂肪墊和肝臟中0.7 %和15 %的巨噬細胞被分類為I4型巨噬細胞(圖6b )。在小鼠器官損傷模型中，包括梗死的心臟，創傷性肌肉損傷和幾種不同的肺纖維化模型中，15-70 %的間質巨噬細胞可以分類為I4細胞(圖6b )。我們將這些研究的IMs與IP或IT α Notch2的IMs進行比較，通過計算相似度得分，將所有研究整合在相同的PCA空間(附圖6a , b)中。與insult條件相關的IM細胞與Notch2阻斷后的IM具有較高的相似性(圖6c )。在I4群體中，在組織損傷小鼠模型中鑒定的I4巨噬細胞比在對照小鼠(附圖6c)中鑒定的I4細胞更類似于α Notch2誘導的I4細胞。有趣的是，在博來霉素誘導的肺纖維化的時間進程研究中發現，在給藥后45天，類似I4型巨噬細胞的細胞持續擴增(圖6d )。為了確定Notch信號在損傷后是否可能被調節，我們使用Cell ChatDB分析了在對照動物和博來霉素損傷后收集的全肺數據中的Notch受體- Notch配體相互作用。這一分析表明，在博來霉素作用后的IM簇中，Notch - Notch配體相互作用減弱(圖6f )。Notch相互作用的喪失與I4巨噬細胞的出現相吻合，并支持在組織損傷和炎癥期間體內Notch信號的喪失可能作為信號促進I4細胞狀態的觀點。

本研究發現Notch2信號阻斷能夠誘導肺部I4型巨噬細胞的增加，這些細胞在博來霉素誘導的肺損傷和SARS-CoV-2感染模型中顯示出抗炎和抗纖維化的作用。實驗結果表明，I4巨噬細胞并非纖維化的驅動因素，反而可能在減輕肺部纖維化和炎癥中發揮保護作用，在過去幾年中，單細胞轉錄組學方法的迅速采用為疾病的發病機制提供了深刻的見解，揭示了新的細胞狀態，如在非適應性組織反應中存在的巨噬細胞。將這種細胞狀態與病理反應的進展聯系起來是很有誘惑力的，我們的結果表明，在許多器官損傷和人類疾病模型中看到的I4巨噬細胞本身并不是促纖維化的，甚至可能是保護性的。需要更精確的遺傳工具和方法來剖析單個細胞狀態在疾病中的作用。

參考文獻：

Cruz Tleugabulova M, Melo SP, Wong A, Arlantico A, Liu M, Webster JD, Lau J, Lechner A, Corak B, Hodgins JJ, Garlapati VS, De Simone M, Korin B, Avraham S, Lund J, Jeet S, Reiss A, Bender H, Austin CD, Darmanis S, Modrusan Z, Brightbill H, Durinck S, Diamond MS, Schneider C, Shaw AS, Nitschké M. Induction of a distinct macrophage population and protection from lung injury and fibrosis by Notch2 blockade. Nat Commun. 2024 Nov 6;15(1):9575. doi: 10.1038/s41467-024-53700-9. PMID: 39505846; PMCID: PMC11541919.