?短鏈脂肪酸靶標定量（代謝組學）檢測分析方案
一、項目簡介
1.1 短鏈脂肪酸概述
短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），也稱揮發(fā)性脂肪酸（Volatile fatty acids，VFA），根據(jù)碳鏈中碳原子的多少，把碳原子數(shù)為1-6的有機脂肪酸稱為短鏈脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸。?
短鏈脂肪酸被后腸迅速吸收后，既儲存了能量又降低了滲透壓，并且短鏈脂肪酸對于維持大腸的正常功能和結(jié)腸上皮細胞的形態(tài)和功能具有重要作用。近端及遠端結(jié)腸內(nèi)SCFAs濃度分別約120mol/L和90mol/L，其中最重要且相對較多（占總量95%）的是乙、丙、丁酸，三者比例大致為3:1:1。受發(fā)酵底物、細菌種類等因素的影響，腸道內(nèi)所產(chǎn)生的短鏈脂肪酸的種類和數(shù)量不同，其發(fā)揮的作用也不盡相同。表1. 腸道內(nèi)主要細菌數(shù)量及代謝產(chǎn)物
1.2 技術(shù)路線
圖1. 短鏈脂肪酸靶標定量（代謝組學）技術(shù)路線圖
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1.3分析內(nèi)容
基礎(chǔ)數(shù)據(jù)分析包括：數(shù)據(jù)預(yù)處理，差異化合物篩選，PCA模式識別。
1.4檢測平臺
分析檢測平臺：GC-FID或GC-MS
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二、檢測分析方案
2.1標準品配置
建立標準物質(zhì)校準曲線，標準物質(zhì)清單見表2：
表2. 標準物質(zhì)列表
我們采用嚴格的質(zhì)量控制體系來保證數(shù)據(jù)的可靠性：
表3. 質(zhì)量控制體系
說明：
⒈精密度：指用某種方法重復(fù)測定同一均質(zhì)樣品所得測定值的彼此接近程度，表示分析結(jié)果的重復(fù)性。常用標準差（SD）或相對標準偏差（RSD）表示。在相同條件下，由一個分析人員測定所得結(jié)果的精密度稱為重復(fù)性；在同一個實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設(shè)備測定結(jié)果之間的精密度，稱為中間精密度；在不同實驗室由不同分析人員測定結(jié)果之間的精密度，稱為重現(xiàn)性。
⒉準確度：指測定值（平均值）與真實值的接近程度，該指標主要是通過回收率來反映。
3.回收率：在空白樣本中添加一定量待測標準樣品，制成已知含量的樣本，然后按擬定的方法對樣本進行提取、凈化和測定。所得到的實測值與已知值比較，實測值與已知值的百分率即為該方法的回收率。
圖1. 標準品校準曲線（以乙酸，丁酸為例）
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2.2數(shù)據(jù)預(yù)處理
對原始數(shù)據(jù)進行峰解卷積，積分，峰對齊，標準化處理。通過原始總離子流(TIC)色譜圖，初步觀察儀器的保留時間重現(xiàn)性，所測得物質(zhì)的情況。
圖2. 代表樣品GC-MS總離子流色譜圖
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2.3 定量結(jié)果
通過標準曲線計算樣品中短鏈脂肪酸的定量結(jié)果，并結(jié)合學氏T檢驗統(tǒng)計組間差異表達的化合物。
表4. 短鏈脂肪酸定量分析結(jié)果
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2.4 PCA分析
對樣本進行主成分分析能從總體上反應(yīng)各組樣本之間的總體代謝差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大小。使用SIMCA軟件(V14.1, Umetrics, Umea, Sweden)，對數(shù)據(jù)進行UV格式化（Unit Variance Scaling）和平均中心化（Mean-Centered）處理，然后進行自動建模分析，以獲得更加可靠且更加直觀的結(jié)果。例圖如下所示：
圖3. PCA模式識別得分圖
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?圖4. PCA模式識別載荷圖
四、時間概算
實驗檢測：45個工作日
數(shù)據(jù)分析：10個工作日
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