自伯豪推出最新單細胞空間轉錄組技術——Xenium原位分析技術，我們已經分享了Xenium原位分析的技術原理，技術特點，樣本制備，以及首篇文獻案例解讀。今天給大家分享另外一篇文獻案例，詳細解析如何通過Xenium技術探究多發性硬化癥疾病進展的動態空間細胞圖譜（目前Xenium技術僅發表兩篇文章，技術紅利期不容錯過?。?/span>。文章標題：Single cell-resolution in situ sequencing elucidates spatial dynamics of multiple sclerosis lesion and disease evolution。

多發性硬化癥(MS)是一種原發于中樞神經系統的炎癥性脫髓鞘疾病，會影響中樞神經系統(CNS)的不同解剖區域，包括大腦、脊髓的白質(WM)和灰質(GM)。對動物進行髓鞘蛋白免疫構建的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)疾病模型與人類MS在臨床、生化、免疫及病理等諸多方面具有相同的特征, 是MS理想的動物模型。

目前已有研究基于單細胞和單核RNA測序技術深入挖掘了MS和EAE中神經元、膠質細胞、血管細胞等各個細胞類型的轉錄差異，但缺乏在整個疾病過程中的真實細胞豐度、空間分布和細胞間相互作用的了解。

該研究先使用單細胞原位測序技術（ISS）對EAE及對照小鼠不同疾病階段（疾病高峰期和疾病晚期），不同解剖區域（腦、頸部脊髓、胸部脊髓、腰部脊髓）進行了檢測，獲得了MS病變過程中的時空動態圖譜。然后利用Xenium原位雜交技術檢測兩個MS患者（病理注釋為活動性和非活動性損傷）的人頸部脊髓組織，以前所未有的分辨率建立MS病變發展和進展的空間細胞譜。

1.?原位測序（ISS）解析EAE中的主要細胞群和狀態

在對照、高峰期和晚期EAE樣本的所有選定解剖區域進行ISS分析后，共檢測到499,978個細胞，通過層級聚類和細胞注釋，得到41個細胞類群。然后，作者對注釋到的神經元，膠質細胞，免疫細胞等主要的細胞群進行亞群細分，并發現有些獨特的細胞亞群表現出對特定解剖區域的空間偏好。

2.?探究EAE小鼠不同病理區室的細胞組成和免疫及炎癥特征

作者首先在空間上繪制并量化了腰椎、胸椎和頸椎脊髓和大腦中免疫細胞組成和占比，發現高峰期EAE脊髓內的免疫浸潤從脊髓尾部到頭部逐漸減輕，但大腦中存在明顯的免疫浸潤。接下來作者分別對高峰期EAE，晚期EAE和對照組的細胞進行鄰域分析，然后聚類注釋得到不同的生理病理區域，最后對得到的各個區域內細胞組成及占比，免疫浸潤及炎癥情況進行詳細的描述與比較。

3.?探究疾病相關的神經膠質細胞的轉錄組特征及空間互作

在解析不同病理區域詳細特征的過程中，作者將目標鎖定到了疾病相關膠質細胞（DA-glial）。因此，作者進一步對高峰期和晚期EAE的DA-glial的轉錄組特征，空間分布，以及與其它細胞的互作關系進行了深入的挖掘。

4.?Xenium技術構建人類MS的空間細胞圖譜

為了將EAE發現與多發性硬化癥（MS）患者的脊髓病理相關聯，作者對兩個注釋為活動性和非活動性損傷的人頸脊髓切片進行了Xenium單細胞原位檢測。Xenium技術使用了有著266個基因的人腦基因panel進行靶向檢測。共鑒定了240,372個細胞，這些細胞平均表達144±95個轉錄本。根據聚類分群和注釋結果，確定了38種細胞群，包括主要的膠質細胞(星形膠質細胞、少突膠質細胞、小膠質細胞和雪旺細胞)、免疫細胞(巨噬細胞、淋巴細胞)、神經元、血管和室管膜細胞。其中一些細胞類型具有空間偏好性，比如灰質(GM)富集較多的神經元和血管軟腦膜細胞。此外，星形膠質細胞和少突膠質細胞亞群MOL_Opalin偏好分布在GM中，而少突膠質細胞亞群MOL_Klk偏好分布在白質（WM）中。推測GM和WM的特異環境可以誘導不同的少突膠質細胞狀態，或者這些區域內的神經元需要特定的少突膠質細胞的支持。

5.?解析人類MS的特定空間病變區域的病理變化

接下來，作者基于Xenium數據進行領域分析獲得不同的病理區域，再進一步注釋各個區域的特征。結果識別出九個成分和空間上不同的病變區域，與病理評估高度一致，且發現了新的病理區域。該結果表明Xenium技術具有識別組織學發現不了的病理變化的能力。最后將小鼠EAE的區域特征結果與人類MS樣本數據聯合，發現小鼠EAE和人類MS樣本中某些神經膠質細胞的狀態和分布是類似的。