New Phytol.(IF=8.1)｜安農(nóng)大宋傳奎教授團(tuán)隊(duì)最新研究刷新認(rèn)知！甜菜堿竟能“解鎖”茶樹抗寒密碼？

英文標(biāo)題：Glycoside-speci?c metabolomics reveals the novel mechanism of glycinebetaine-induced cold tolerance by regulating apigenin glycosylation in tea plants

中文標(biāo)題：糖苷特異性代謝組學(xué)揭示了甜菜堿通過調(diào)節(jié)芹菜素糖基化誘導(dǎo)茶樹抗寒的新機(jī)制

發(fā)表期刊：New Phytologist

影響因子：8.1
 

研究背景

茶樹(Camellia sinensis)因其豐富的次生變質(zhì)巖而被公認(rèn)為世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，主要生長在溫暖潮濕的熱帶和亞熱帶地區(qū)。但近年來，全球氣候變化導(dǎo)致早春冷害和凍害頻發(fā)，明顯制約了其生長發(fā)育和生態(tài)分布，從而阻礙了茶業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。當(dāng)植物經(jīng)歷冷脅迫時(shí)，它們的代謝物發(fā)生修飾，包括甲基化和糖基化，這在調(diào)節(jié)溶解度、穩(wěn)定性、以及各種次生代謝物的生物活性，這與植物對(duì)冷脅迫的耐受性有著復(fù)雜的聯(lián)系。糖基化是脅迫下影響次生代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵修飾，受甘氨酸甜菜堿(Glycinebetaine, GB)影響，調(diào)控植物的抗逆性。然而，糖苷的復(fù)雜性和檢測挑戰(zhàn)阻礙了應(yīng)激下其與GB代謝相互作用的調(diào)節(jié)機(jī)制的理解。

近期，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)宋傳奎教授團(tuán)隊(duì)在New Phytologist上發(fā)表了題為"Glycoside-specific metabolomics reveals the novel mechanism of glycinebetaine-induced cold tolerance by regulating apigenin glycosylation in tea plants"的研究論文。該研究開發(fā)了一種利用錐孔電壓誘導(dǎo)源內(nèi)裂解的糖苷特異性代謝組學(xué)方法，揭示了GB通過調(diào)節(jié)芹菜素糖苷化誘導(dǎo)茶樹耐寒性的新機(jī)制，拓寬了對(duì)糖苷化在植物抗寒作用的理解。
 

研究結(jié)果

茶樹糖苷特異性代謝組學(xué)方法的建立

糖基化導(dǎo)致代謝物底物分子量增加，當(dāng)應(yīng)用CV誘導(dǎo)源內(nèi)解離時(shí)，糖苷在底物和糖苷修飾基團(tuán)之間的鍵處發(fā)生解離。隨后，采用高分辨率質(zhì)譜分析儀同時(shí)檢測糖苷的前體離子和片段離子（即苷元），從而產(chǎn)生特定的NL值（圖1a-c）。基于這一原理，本研究首先通過標(biāo)準(zhǔn)品確定了能誘導(dǎo)糖苷源內(nèi)解離的初始CV。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CV從40V增加到50V時(shí)，前體離子及其二聚體對(duì)兩種標(biāo)準(zhǔn)樣品的響應(yīng)值均略有增加，這表明較高的CV有利于更多離子的進(jìn)入（圖1d）。然而，還觀察到苷元離子和其他片段的響應(yīng)值顯著增加，表明這兩種苷在CV=50V時(shí)開始進(jìn)行源內(nèi)解離。山奈酚-3-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-新橙皮苷和牡荊素-2-O-鼠李糖苷的鍵解離模式與槲皮素7-O-葡萄糖苷非常相似(圖1e)。因此，推斷CV=40V代表糖苷源內(nèi)解離的閾值。在確定初始CV之后，進(jìn)一步研究了茶樹中糖苷源內(nèi)解離最大化的CV范圍。因此，在 50、60、70、80和90V的CV下觀察四種標(biāo)準(zhǔn)品的鍵解離模式，以確定最適CV范圍。結(jié)果表明，當(dāng)CV從40V增加到70V時(shí)，槲皮素7-O-葡萄糖苷的響應(yīng)略有增加，而其二聚體的響應(yīng)略有下降。將CV從70增加到90V，槲皮素7-O-葡萄糖苷的響應(yīng)相對(duì)穩(wěn)定，而其二聚體的響應(yīng)明顯下降。同時(shí)，還觀察到大量苷元離子的產(chǎn)生(M-H-NL=301.0374)，表明在此CV范圍內(nèi)，糖苷發(fā)生了相當(dāng)大的源內(nèi)解離，二聚體的解離有助于前體離子的產(chǎn)生，從而穩(wěn)定了槲皮素7-O-葡萄糖苷的響應(yīng)值（圖1d）。山奈酚-3-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-新橙皮苷和牡荊素-2-O-鼠李糖苷的鍵解離模式與槲皮素7-O-葡萄糖苷的鍵解離模式非常相似(圖1e)，表明這兩種標(biāo)準(zhǔn)物在該CV范圍內(nèi)都發(fā)生了相當(dāng)大的源內(nèi)解離。因此，本實(shí)驗(yàn)的CV范圍被確定為40-90V。綜上，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定初始CV為40V，并在該電壓下對(duì)單個(gè)樣品進(jìn)行常規(guī)全局代謝分析。CV范圍確定為40-90V，且以5V為增量進(jìn)行梯度設(shè)置。

圖1 茶樹糖苷特異性代謝組學(xué)策略

用CsBADH1評(píng)價(jià)糖苷特異性代謝組學(xué)方法的效率

通過鑒定顯著差異代謝物來評(píng)估苷特異性代謝組學(xué)的效率，并利用該方法闡明冷響應(yīng)基因CsBADH1對(duì)茶樹糖苷的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，常規(guī)全局代謝組學(xué)分析從茶苗提取物中檢測到超過4000種獨(dú)特的可量化代謝物特征。具體而言，在ESI+模式下鑒定出2147個(gè)特征，在ESI-模式下鑒定出1941個(gè)特征（圖2a）。對(duì)CsBADH1沉默和對(duì)照茶苗的代謝譜進(jìn)行單變量分析，發(fā)現(xiàn)超過1000個(gè)代謝物特征，與之形成鮮明對(duì)比的是，糖苷特異性代謝分析僅鑒定出不到200個(gè)糖苷離子，其中ESI+模式下有65個(gè)，ESI-模式下有124個(gè)（圖2b）。單因素分析表明，CsBADH1沉默的茶苗中70個(gè)糖苷離子的水平發(fā)生顯著變化。在CsBADH1沉默的茶樹中，預(yù)計(jì)發(fā)生顯著變化的70個(gè)糖苷離子包括28個(gè)單糖苷、21個(gè)雙糖苷和21個(gè)三糖苷（圖2b）。這些結(jié)果表明，苷特異性代謝組學(xué)分析可同時(shí)鑒定具有不同糖數(shù)量和糖類型的多種糖苷。當(dāng)對(duì)同一化合物進(jìn)行不同糖苷修飾的重復(fù)計(jì)數(shù)時(shí)，候選糖苷離子的總數(shù)減少到60個(gè)。因此，與傳統(tǒng)的全局代謝組學(xué)相比，糖苷特異性代謝分析大大減少了未知代謝物的數(shù)量，并將目標(biāo)離子范圍縮小了94.3%。在源內(nèi)解離過程中，具有特定分子量的代謝物的糖基化可以通過中性丟失(NL)途徑消除，從而產(chǎn)生獨(dú)特的NL模式。G1的中性丟失為m/z=162.0424(Δ=0.104)，表明其發(fā)生了糖基化（圖1c）。根據(jù)MS/MS譜圖，從先前鑒定并確認(rèn)為糖苷的60個(gè)候選離子中選擇了15個(gè)糖苷離子（圖2c）。在這15個(gè)糖苷離子中，9個(gè)為單糖基化，包括葡萄糖基化/半乳糖基化、鼠李糖基化以及阿拉伯糖基化/木糖基化。

圖2 通過CV誘導(dǎo)源內(nèi)解離準(zhǔn)確表征茶樹中的糖苷

CsBADH1通過調(diào)節(jié)冷響應(yīng)性糖苷來調(diào)節(jié)耐寒性

為了研究CsBADH1在低溫脅迫下茶樹中的可能作用，分析了4℃低溫馴化0、1、3、5和7d茶樹中CsBADH1基因的表達(dá)水平和相對(duì)GB含量。CsBADH1的表達(dá)水平在4℃下顯著上調(diào)，并隨冷暴露時(shí)間持續(xù)上調(diào)。相應(yīng)地，GB含量也呈現(xiàn)相似趨勢（圖3a）。這些結(jié)果表明，CsBADH1可能參與茶樹的GB生物合成和冷脅迫響應(yīng)。為了進(jìn)一步研究CsBADH1在茶樹中的功能，我們首先獲得了純化的BADH酶，并通過合適的酶催化反應(yīng)體系，在體外確定了其誘導(dǎo)GB合成的功能（圖3b）。隨后，用CsBADH1沉默的茶樹進(jìn)行耐冷性測定。結(jié)果表明，CsBADH1沉默植株對(duì)冷脅迫表現(xiàn)出顯著的敏感性表型，CsBADH1表達(dá)量和GB含量顯著降低(圖3c-e)。葉片光合活性顯著低于非沉默植株，F(xiàn)V/FM值也顯著降低(圖3f)。這些結(jié)果表明，CsBADH1參與GB的生物合成，并積極調(diào)節(jié)茶樹的耐寒性。緊接著，對(duì)因CsBADH1沉默而發(fā)生顯著變化的糖苷與低溫誘導(dǎo)發(fā)生顯著變化的化合物進(jìn)行了相關(guān)性分析。取兩者的交集，共篩選出9個(gè)同時(shí)受CsBADH1和低溫誘導(dǎo)變化的苷類化合物(圖3g)。其中，一個(gè)糖苷離子(m/z=579.1708)在CsBADH1沉默植株中比非沉默植株顯著上調(diào)，且在低溫處理植株中與室溫對(duì)照植株相比也呈顯著上調(diào)趨勢。其中，一個(gè)糖苷離子(m/z=579.1708)在CsBADH1沉默植株中比非沉默植株顯著上調(diào)，且在低溫處理植株中與室溫對(duì)照植株相比也呈顯著上調(diào)趨勢。然后通過將糖苷離子與假定的糖苷標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行比較，確定糖苷離子為異野漆樹苷(圖3h)。色譜圖進(jìn)一步表明，與非沉默組相比，沉默CsBADH1導(dǎo)致茶樹中異野漆樹苷含量顯著增加(圖3i)。最后，對(duì)茶葉進(jìn)行外源GB噴施處理，結(jié)果表明，噴施GB后，茶樹內(nèi)源GB含量顯著增加，異野漆樹苷含量呈下降趨勢(圖3j-k)。總體而言，CsBADH1可以上調(diào)GB水平，下調(diào)異野漆樹苷水平，同時(shí)正向調(diào)節(jié)茶樹的耐寒性

圖3 發(fā)現(xiàn)同時(shí)對(duì)甜菜堿醛脫氫酶(CsBADH1)和冷反應(yīng)的糖苷

CsBADH1介導(dǎo)的冷響應(yīng)糖苷、異野漆樹苷及其前體芹菜素在茶樹耐寒性中的作用

為了研究鑒定到的糖苷在寒冷脅迫下茶樹中的潛在作用，首先確定了異野漆樹苷及其前體芹菜素對(duì)寒冷的響應(yīng)模式。DESI-MS分析結(jié)果直觀地顯示，冷處理后，芹菜素和異野漆樹苷的離子響應(yīng)值呈現(xiàn)明顯上升趨勢(圖4a)，說明兩者均為冷反應(yīng)代謝物。隨后，為了進(jìn)一步闡明兩者對(duì)低溫的反應(yīng)，對(duì)茶樹進(jìn)行了外源噴灑異野漆樹苷及其前體芹菜素和耐寒性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，噴施異野漆樹苷導(dǎo)致內(nèi)源異野漆樹苷在茶葉中積累，導(dǎo)致茶葉出現(xiàn)冷敏表型，F(xiàn)V/FM值顯著降低(圖4b-d)。噴施芹菜素能顯著提高茶樹內(nèi)源芹菜素水平(圖4e)，但對(duì)茶樹的表型沒有顯著影響，略微提高FV/FM值(圖4b-c)，表明芹菜素正向調(diào)控茶樹的耐冷性。為了進(jìn)一步證明芹菜素在低溫脅迫下對(duì)茶樹的作用，對(duì)芹菜素合成的關(guān)鍵基因FNS進(jìn)行了基因沉默處理，然后進(jìn)行了耐寒性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，FNS沉默植株對(duì)冷脅迫表現(xiàn)出明顯的敏感性表型，FNS表達(dá)水平和芹菜素含量顯著降低(圖4f-h)。葉片光合活性顯著低于非沉默植株，F(xiàn)V/FM值顯著降低(圖4i)。這些結(jié)果表明，FNS介導(dǎo)的芹菜素生物合成對(duì)茶樹的耐寒性有積極的調(diào)節(jié)作用。

圖4 異野漆樹苷及其前體芹菜素在茶樹耐寒性中的作用

GB和芹菜素通過減輕ROS損傷增強(qiáng)冷脅迫耐受性

已有研究表明，GB和芹菜素具有一定的抗氧化作用，能夠清除自由基和活性氧(ROS)，且與植物的脅迫耐受性相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步驗(yàn)證了GB、芹菜素和異野漆樹苷是否能通過清除ROS和增強(qiáng)抗氧化活性來提高茶樹的耐寒性。結(jié)果顯示，CsBADH1沉默植株對(duì)冷脅迫表現(xiàn)出顯著的敏感表型，O??和MDA含量顯著增加，而總抗氧化能力(T-AOC)顯著降低（圖5a），表明GB可通過清除ROS和增強(qiáng)抗氧化活性來提高茶樹的耐冷性。芹菜素和異野漆樹苷噴施實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，噴施異野漆樹苷可導(dǎo)致H?O?和O??積累，而噴施芹菜素顯著減少H?O?積累，并提高T-AOC(圖5b)。這表明芹菜素可以通過清除ROS和增強(qiáng)抗氧化活性來提高茶樹的耐寒性，而異野漆樹苷則不具有這一功能。FNS沉默實(shí)驗(yàn)顯示，FNS沉默植株中H?O?和O??的積累顯著增加，同時(shí)T-AOC顯著降低，并伴隨MDA積累，這也支持上述結(jié)論（圖5c）。

圖5 甜菜堿(GB)、異野漆樹苷及其前體芹菜素對(duì)低溫脅迫下茶樹活性氧清除和抗氧化活性的影響

研究結(jié)論

本研究建立的苷特異性代謝組學(xué)方法為植物糖苷檢測及相關(guān)代謝研究提供了高效工具，可擴(kuò)展用于其他代謝物修飾分析。并且首次揭示GB通過調(diào)控芹菜素糖基化介導(dǎo)茶樹耐冷性的機(jī)制，拓寬了對(duì)植物次生代謝（尤其是糖基化）在耐冷性中作用的認(rèn)知。為茶樹耐冷品種培育、低溫防控技術(shù)研發(fā)提供理論依據(jù)，GB和芹菜素有望作為綠色調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

甜菜堿（GB）通過調(diào)節(jié)芹菜素糖基化誘導(dǎo)耐寒的新機(jī)制

END

Tang 撰文

Weyne 校稿