挫傷是日常生活中最常見的一類機械性損傷，其損傷時間推斷是法醫病理學研究熱點和難點之一。 損傷時常伴隨骨骼肌挫傷，局部出現紅、腫、熱、痛和功能障礙。挫傷早期，在受損部位炎癥因子的趨化作用下，中性粒細胞從血管滲出并向壞死部位定向趨化移動，吞噬和清除壞死組織， 從而為損傷區組織修復和再生創造條件。因此，中性粒細胞對于早期損傷時間推斷具有重要研究價值。
山西醫科大學法醫學院團隊建立大鼠損傷模型，并在損傷后不同時間點從對照組和實驗組獲得骨骼肌樣品。通過蘇木精和伊紅（HE）染色和免疫組化（IHC）染色檢測細胞核和中性粒細胞的表達。然后在所有時間點隨機選擇20個0.25mm2（0.5mm×0.5mm）的受傷部位進行分析。
實驗中，應用TissueFAXS 200數字病理分析系統快速，準確地識別了挫傷骨骼肌再生過程中的MPO標記的中性粒細胞，對中性粒細胞在骨骼肌損傷 后的浸潤過程進行定性、定位、定量分析，同時應用組織細胞定量分析系統，檢測中性粒細胞在炎癥階段的浸潤面積，以評估損傷時間。
該文章2020年3月發表在Forensic Science Research。
實驗方法
利用TissueFAXS 200數字病理分析系統在骨骼肌挫傷再生過程中識別中性粒細胞，以免疫組化樣本的染色強度和染色面積作為參數識別細胞核，實驗中設置不同的核面積參數，逐步優化細胞核識別數量。并使用ROC曲線分析確定染色區域的cut-off值。研究通過免疫組織化學染色技術標記 MPO 以特異性識別中性粒細胞。（本文章中所有圖像獲取及分析結果均來自TissueFAXS 200系統）
圖1 篩選有效細胞核并計數中性粒細胞
首先，利用 StrataQuest軟件對明場拍攝的IHC樣本中蘇木素和DAB染色通道進行拆分，通過蘇木素通道識別細胞核后，利用著色的細胞核強度和細胞面積作為參數，排除黏連細胞及細胞碎片；繼而，以細胞核為核心尋找胞質范圍內存在的DAB染色陽性區域，通過 DAB 顯色強度和著色面積作為參數，對陽性中性粒細胞進行識別篩選。
在篩選陽性中性粒細胞的過程中，調節DAB染色面積的cut-off線，獲得不同陽性率數值。結合TissueGnostics公司的正反向回溯追蹤功能，可以實時獲得不同篩選標準下的量化標準；隨后，由5名病理學專家對相同樣本進行判定獲得肉眼讀片數據，作為比較的基準；最后，將兩者數值相比，得到染色面積cut-off值的假陽性（FP）和假陰性（FN）數量，敏感性，特異性和ROC曲線等數據。
實驗結果
1 骨骼肌組織樣本
圖2 挫傷后骨骼肌和對照組的HE染色樣本
2 TissueFAXS 200數字病理分析系統重復性驗證
將0.25mm2（0.5mm×0.5mm）（n = 20）的20個受傷部位隨機分配，并重復進行9次測試。 重復測試給出的結果相似，變異系數（CV）為0％，表明該儀器具有良好的重復性和穩定性。
3 損傷后不同時間點大鼠骨骼肌細胞核的識別和定量
在StrataQuest軟件中自動識別蘇木素和DAB染色區域后，通過染色面積和平均強度在不同調節染色面積cut-off值識別細胞核和中性粒細胞。
圖3 損傷后不同時間點大鼠骨骼肌細胞核的識別和定量
A 蘇木素染色免疫組化樣本
B 損傷后不同時間點的細胞核表達散點圖
C 圖（A）陰性對照組分析區域散點圖
D 損傷后不同時間點的細胞核表達
4 不同cut-off值的中性粒細胞的表達
圖4.不同的染色面積cut-off值嗜中性粒細胞的變化。
中性粒細胞在組織損傷后早期階段炎癥情況和估計損傷時間中起著重要作用。
A 在染色區域的不同cut-off值中性粒細胞數目變化的散點圖；
B 同區域中，隨著染色區域的cut-off值增加，預測陽性的數目減少而預測陰性的數目增加；
C 隨著染色區域的cut-off值增加，觀察到的假陽性的數目減少而假陰性的數目增加；
D 隨著染色區域的cut-off值增加，真陽性的數目減少而真陰性的數目增加。
5 不同損傷時間中性粒細胞的相對表達
當染色區域的cut-off值為12μm2時，使用TissueFAXS
200數字病理分析系統檢測免疫組化圖像中性粒細胞的數量和百分比。計算每個受傷區域的MPO陽性中性粒細胞相對于細胞核總數的平均比率。
通過TissueFAXS 200全景組織細胞高通量定量分析系統，使用基于圖像的定量分析方法，以及整合的傳統病理讀片判定標準，可以建立具有良好的重復性及穩定性，以及更為客觀精準的定量分析流程。在法醫病理，疾病預后，治療效果評估等等領域具有廣泛的應用。