脊索瘤是一種罕見且局部侵襲性的間葉性腫瘤，源于原始脊索殘余，好發于骶骨和顱底區域，對傳統化療不敏感，目前最佳治療是手術切除聯合輔助放療，但因腫瘤的浸潤性及靠近關鍵神經血管結構，根治性切除有挑戰，術后易復發或轉移。癌相關成纖維細胞(CAFs)是基質中的主要細胞類型，其密度與許多惡性腫瘤的侵襲、轉移和不良預后相關，在脊索瘤中，基質成分與腫瘤侵襲表型、患者生存和免疫反應有關，但CAFs對脊索瘤發展和進展的影響尚不清楚。本研究利用scRNA - seq(n=9)、ST RNA-seq(n=3)、bulk RNA-seq(n=128)和QIF(n=105)來確定脊索瘤中CAFs的細胞類型、空間分布和臨床意義，首先通過scRNA - seq對CAFs進行綜合表型研究，然后用多模態交叉分析將scRNA - seq的CAFs圖譜與ST數據整合，最后用bulk RNA - seq和QIF驗證觀察結果，有助于更好地理解CAFs在脊索瘤進展中的生物學功能，并為開發新的治療策略提供思路。

snRNA-seq、ST RNA-seq、bulk RNA-seq

1. 單細胞轉錄組識別脊索瘤圖譜

對6名脊索瘤患者(3名原發、3名復發)以及3名髓核(NP)進行單細胞測序。共獲得72097個細胞，其中46987個來自脊索瘤，25110個來NP組織。識別出49個細胞群，通過marker基因可分為上皮樣細胞、單核吞噬細胞、T細胞、內皮細胞、中性粒細胞、B細胞、破骨細胞、成纖維細胞、軟骨細胞和壁細胞10種類型(圖1A-E)。上皮樣細胞、成纖維細胞、T細胞和B細胞屬于多個群，表明這些細胞類型具有異質性(圖1A)。與NP組織相比，脊索瘤組織中上皮樣細胞較多，尤其是復發性腫瘤(圖1C)。通過inferCNV分析、及細胞周期分析表明上皮樣細胞具有顯著高的拷貝數變異(CNV)水平并處于增值狀態，綜合這些結果表明上皮樣細胞代表腫瘤細胞。

2. 脊索瘤微環境中功能獨特的CAF群體識別

為進一步研究成纖維細胞，研究人員對其進行亞群的細分，基于特定細胞標志物確定了 6個主要的成纖維細胞亞群(圖2A-B)。用熱圖展示各群中前10個差異表達基因(DEGs)的表達水平來可視化6個癌相關成纖維細胞(CAF)亞群間的關鍵差異(圖2C)。其中，成纖維細胞 - 1 和 - 5僅在脊索瘤中觀察到，提示它們是脊索瘤特異性 CAFs(圖2D)。比較分析表明 CAFs、癌細胞和正常成纖維細胞在干性和細胞周期分數上無顯著差異(圖 2E)，功能富集分析顯示CAFs與成纖維細胞和癌細胞有共同活動(圖2F)。在轉錄組水平，CAFs 高表達成纖維細胞(如COL1A1和COL6A1)和腫瘤細胞(如SPP1和RARRES21)的標志物基因(圖2G)。

3. 成纖維細胞聚集揭示與脊索瘤進展相關的獨特亞群

為識別CAF亞群并闡明其功能，研究人員對脊索瘤組織中的所有CAFs(成纖維細胞 - 1和 - 5細胞)進行了降維分析。確定了4個CAF亞群，其中CAF - 1和CAF - 2為主要亞型(圖3A)，它們都高表達CAFs的特定marker基因，如POSTN、THY1、ACTA2等(圖3B)，同時展示4個CAF群之間的基因表達差異(圖3C)。分析CAF亞群的起源，發現CAF-2存在于復發性腫瘤中，CAF-3和CAF-4存在于原發性腫瘤組織中，CAF-1在兩種腫瘤組織中均存在(圖3D)?；贕O富集分析，CAF-2與內質網應激(ERS)反應相關，其特征是高表達ERS相關和缺氧基因(HSPA1A、HSPA1B、CCL2等)；CAF-1與能量代謝相關，高表達SPP1、RBP4、AGT等；CAF-3與中性粒細胞激活有關，表達MMP9、ACP5、CKB等；CAF-4主要促進骨骼系統發育，表達IBSP、IFITM5、DLX5等(圖3E-I)。CAF-4也高表達缺氧和ERS相關基因，但功能富集分析未顯示CAF-4與ERS反應有關。綜合結果表明，只有CAF-2可能參與ERS過程。由于CAF-2僅存在于復發性腫瘤組織中，且ERS和缺氧信號通路的異常激活是腫瘤進展的關鍵調節因素，推測CAF-2可能與脊索瘤進展有關。

4. GSVA表明ERS-CAF特征評分與脊索瘤進展相關

為驗證ERS - CAF的促腫瘤作用，研究人員對126例脊索瘤患者樣本進行bulk RNA - seq(圖4A)。用代表該CAF子集的基因集(包括ERS相關基因如 HSPA1A、HSPA1B、CCL2、及CAF特異性標志物如THY1、FAP、COL1A1)計算每位患者的ERS - CAF特征評分；該評分與腫瘤侵及周圍肌肉、腫瘤分級、AJCC分期、手術切緣顯著相關，復發性腫瘤患者評分略高但差異不顯著(圖4B)。通過在線平臺確定閾值將患者分組進行生存分析，Kaplan - Meier分析顯示評分升高預示不良的無局部復發生存率(LRFS)和總生存率(OS)(圖4C)，在Cox多元回歸模型控制重要臨床因素后仍顯著(圖4D - E)。

5. ERS-CAF可能從不同方面促進脊索瘤進展

為推斷ERS - CAF亞群促進腫瘤進展的可能機制，研究人員進一步分析CAF亞群與其他細胞類型的細胞間通訊。結果顯示CAF亞群(尤其是ERS - CAFs和CAF-1)顯著激活并與多種細胞相互作用(圖5A-B)，確定許多配體-受體對展示ERS - CAF與脊索瘤主要細胞類型間的廣泛分子相互作用。對于傳入信號，ERS - CAFs主要接受來自CD46、EFG、SELL等分子的信號；對于傳出信號，主要產生TENASCIN、IGF、LIFR等信號(圖5D)，且ERS - CAFs是幾個細胞通訊網絡(包括JAM、THBS和GDF信號通路)的核心細胞(圖5E)。對10個腫瘤組織樣本進行QIF分析進一步證實ERS - CAF和腫瘤細胞間JAM2和JAM3的交互信號，發現腫瘤細胞靠近ERS - CAF的區域JAM2/JAM3信號表達更強，表明ERS- CAFs可通過多種分子機制促進脊索瘤進展。

6. ERS-CAF與其他細胞類型的空間關系

為進一步剖析脊索瘤組織中ERS - CAF的空間特征，對3個新鮮腫瘤樣本(圖6A、 G)進行了空間轉錄組測序。在ST數據中觀察到UMIs與標記基因之間有很強的相關性(圖 6B 、H)，表明質量良好。在ST數據中檢測到上皮樣細胞(KRT8)、單核吞噬細胞(CD14)、T 細胞(CD3D)、內皮細胞(PECAM1)、中性粒細胞(CSF3R)、B 細胞(CD79A)、成纖維細胞(COL2A1)和壁細胞(ACTA2)的標記基因(圖6C 、 I)。隨后，通過UMAP方法降維在原發性和復發性腫瘤樣本中均確定了8個主要細胞群(圖6D、J)。在原發性腫瘤中觀察到CAF-1，而在復發性腫瘤樣本中同時觀察到CAF-1和ERS - CAF(圖 6D 、 J)。通過CAF標記基因的基因表達分析(圖 6E 、K)和MIA結果(圖 6F 、 L)證實了這些發現。使用鄰域得分和接近度得分來表征每個 ERS - CAF 位點周圍的細胞類型組成。分析顯示ERS - CAF與腫瘤細胞之間具有高鄰域得分和接近度得分，表明這兩種細胞類型之間有很高的相互作用概率。此外，對ST數據的stLearn分析表明ERS - CAF與脊索瘤細胞之間存在相互作用。

對3個原發性和3個復發性腫瘤樣本以及3個髓核樣本作為對照的72 097個單細胞進行了測序。在復發性腫瘤中發現了一個獨特的CAF群，該群高度表達缺氧基因并在內質網應激 (ERS) 中功能性富集。擬時間軌跡和細胞通訊分析表明，該ERS-CAF亞群起源于正常成纖維細胞，并與腫瘤和免疫細胞廣泛相互作用。通過分析126名患者的bulk RNA-seq 數據，研究人員發現，ERS-CAF特征評分與脊索瘤的侵襲和不良預后有關。通過將 scRNA-seq 的結果與空間轉錄組學相結合，證明了ERS-CAF在脊索瘤組織中的存在，并揭示了這種CAF 亞型與周圍腫瘤細胞的距離最接近。在隨后涉及105名另外患者的QIF驗證中，證實 ERS-CAF在脊索瘤微環境中豐富且靠近腫瘤細胞。此外，ERS-CAF 密度及其與腫瘤細胞的距離都與腫瘤惡性表型和不良患者結果相關。