作為近幾年興起的突破性技術，mRNA技術通過脂質納米顆粒（ LNP ）將mRNA導入體內來表達抗原蛋白，以刺激機體產生特異性免疫反應。新冠肺炎疫情（ COVID-19 ）爆發后，針對性的mRNA疫苗在多種疫苗類型中脫穎而出。與此同時，環狀RNA（ circRNA ）以其高度穩定的結構，不需要修飾核苷酸和加帽加尾修飾等優勢，逐漸走入大眾視野，并迅速引發資本市場和業內研究人員的高度關注。
circRNA 技術路線：
1 模板制備
在該環節中，高質量的質粒制備尤為重要，關系到后續體外轉錄產物的質量。環狀質粒由于無有效的終止，會轉錄出不同長度的RNA產物。為了得到特定長度的RNA，質粒必須完全線性化，線性化的質粒需確保雙鏈為平末端或5’端為突出結構。此外，為了使轉錄產物中不帶有酶切位點殘基序列，通常質粒線性化時需要使用IIS型限制性內切酶進行質粒酶切。近岸蛋白提供GMP級生產BsaI（Cat#GMP-RE026）、BspQI（Cat#GMP-RE057）和XbaI（Cat#GMP-RE015）限制性內切酶，高效線性化質粒。
1.1 Bsa I，GMP Grade，Cat#GMP-RE026
限制性內切酶Bsa I 特異性識別雙鏈DNA中位點并進行酶切，可將模板質粒酶切線性化，制備mRNA體外合成模板；
酶切位點：
產品特點：
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強特異性；
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受CpG、Dcm甲基化影響，剪切阻斷；
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受EcoBI甲基化影響，剪切可能受影響；
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不受Dam甲基化影響。
50μl 酶切體系內，1U BsaI 引入量前提下，調整質粒加量進行酶切，結果顯示 BsaI 可完全酶切 10μg 質粒。受質粒類型及超螺旋比例等因素影響，酶切效率有較大差異，需根據實際情況調整酶切體系。
1.2 BspQI, GMP Grade，Cat#GMP-RE057
限制性內切酶BspQI特異性識別雙鏈DNA中位點并進行酶切，可將模板質粒酶切線性化，制備mRNA體外合成模板；
酶切位點：
產品特點：
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對Dam、Dcm和哺乳動物CpG甲基化不敏感。
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BspQI的同裂酶有LguI、PciSI、SapI。
1.3 XbaI, GMP Grade，Cat#GMP-RE015
限制性內切酶XbaI特異性識別雙鏈DNA中位點并進行酶切，可將模板質粒酶切線性化，制備mRNA體外合成模板；
酶切位點：
2 RNA 體外轉錄
此步以DNA為模板，在體外由RNA聚合酶催化合成mRNA。
2.1 T7 RNA Polymerase, GMP Grade，Cat#GMP-E121，Cat#GMP-E122
作為生物大分子，mRNA可通過體外轉錄（IVT，in vitro transcription）的方法大規模合成，T7啟動子是目前轉錄效率最高的啟動子之一，因此采用T7 RNA Polymerase進行體外轉錄可簡單快速獲得大量的RNA分子。T7 RNA Polymerase是體外轉錄生產治療用mRNA的關鍵酶。
dsRNA作為體外轉錄的副產物之一，能夠被對應的核酸受體識別，引發天然免疫炎癥反應，嚴重影響mRNA疫苗的效果，在生產過程中需要嚴格控制。經分子進化改造獲得的T7 RNA聚合酶突變體（目錄號：GMP-E122）可明顯降低轉錄產物中dsRNA的含量。
產品特點：
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有效降低dsRNA含量
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產量高，150-250μg/20μl反應體系
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共轉錄體系加帽率高
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可轉錄不同長度片段，產物完整性好
2.2 RNase inhibitor, GMP Grade，Cat#GMP-E125
RNase Inhibitor可與RNase A形成1：1復合體，對RNase 有極強非競爭性抑制，保護mRNA轉錄后不被降解
產品特點：
強抑制RNase活性；
穩定性強，適合更高轉錄溫度體系探索。
2.3 Pyrophosphatase, Inorganic (yeast), GMP Grade，Cat#GMP-M036
RNA體外合成過程中加入無機焦磷酸酶，增加RNA產量。
Pyrophosphatase, Inorganic可催化無機焦磷酸鹽水解生成P2O74-+H2O+PPase→2HPO42-，一方面可去除無機焦磷酸鹽對反應體系的抑制，另一方面為反應提供熱力學動力，促進產物的生成，在mRNA疫苗體外大規模合成中加入可顯著提高產量。
2.4 核苷酸，Cat#GMP-S033-036D
核苷三磷酸（ NTP ）可用于分子生物學中多種相關應用；
3 模板去除（DNaseI, GMP Grade，Cat#GMP-E127）
此步為RNA轉錄結束后，雙鏈DNA模板去除
4 RNA環化
環化工藝有三種不同的制備方法，不同的方式、不同的RNA長度都可能帶來不同的環化效率。以I型內含子為基礎，搭配有助于剪接的輔助序列，可實現環化1500nt以上的RNA。II型內含子剪接有酵母菌或破傷風桿菌來源，Ⅱ型內含子的自催化剪接反應可以在體外人工制備環狀RNA，利用Ⅱ型內含子的六個結構區域中的（D1-D3）以及（D5-D6）序列倒轉，可以形成自剪接活性的核酶，此種方法制備的環狀RNA沒有外來序列的殘留。通過酶法環化可以避免外源序列引入導致的免疫原性，同時發展了借助內源性的夾板鏈實現RNA的環化。
近岸蛋白提供GMP級T4 RNA Ligase 2（Cat#GMP-M050），助力circRNA藥物開發及申報。
5 circRNA 純化
環化結束后，需要通過系列純化手段對circRNA進行高純度回收，由于不同環化方式的效率差異，RNase R的引入，有效去除未環化的線性RNA，從而達到純化circRNA的目的。RNase R幾乎能夠消化所有線性的RNA，但不易消化環狀RNA、套索結構RNA和3'端突出少于7個核苷酸的短雙鏈RNA分子。近岸蛋白經過系列驗證，重磅推出高活性RNase R（Cat#GMP-E224）。
qRT-PCR 驗證實驗
細胞表達驗證
經RNase R消化后的eGFP circRNA轉染細胞后，表達量更高。
產品信息
