結直腸癌（CRC）是全球第二大致死性癌癥，從基因組層面而言主要由染色體不穩定性（CIN）或微衛星不穩定性（MSI）引起。MSI指當基因錯配修復功能（MMR）受損時，DNA復制過程中的堿基錯配大量積累的現象，因而也被稱為錯配修復缺陷（d-MMR）。驅動兩種基因組不穩定性的突變不同：CIN由APC、TP53、KRAS、SMAD4和PIK3CA突變引起；MSI型CRC則與AXIN1、AXIN2、ACVR2A、TGFBR2、BMPR2和BRAF突變緊密相關。

1990年，美國科學院院士Vogelstein和Fearon教授提出Vogelgram模型[1]，描述了CRC腺瘤-癌癥序列發展進程同遺傳及基因組變化之間的聯系（圖1）。不過，考慮到CRC整個癌變過程往往歷時數十年，其腺瘤-癌癥序列難以在體外被完整捕捉，真實可靠的體外模型尤其匱乏。

圖1：結直腸腫瘤發生的遺傳模型Vogelgram

（來源：參考資料[2]）

2024年11月1日，荷蘭烏特勒支大學Hans Clevers教授團隊在期刊Nature Cancer發表了題為“Recapitulating the adenoma–carcinoma sequence by selection of four spontaneous oncogenic mutations in mismatch-repair-deficient human colon organoids”的研究論文，首次基于類器官模型在體外跟蹤描述了CRC腺瘤-癌序列發展中涉及到的四種關鍵信號通路突變。研究證明，這些突變中Wnt通路首先發生，p53、BMP通路及EGFR通路緊隨其后，相應的突變基因及點位得到闡述。通過生長因子的連續剝奪和添加，本研究成功篩選出自發突變的腫瘤類器官，并在移植小鼠后于體內成功誘導CRC發生，再次強調了該平臺作為體外腺瘤-癌序列發展研究模型的可靠性。

（來源：參考資料[3]）

Wnt、EGFR、BMP、p53等通路的激活或抑制已被證明與MMR缺陷型（d-MMR）CRC的腺瘤-癌序列的演進緊密相關。為了在體外解碼其背后的基因突變機理，研究人員選擇了類器官模型MLH1^KO。此模型通過敲除（KO）MLH1基因，可于體外短期培養中重現d-MMR型CRC突變特征。

本研究中，MLH1^KO在體外長期培養并積累了大量的自發突變。研究人員通過在培養基中獨立地去除相關通路的生長因子，如Wnt、R-spondin 1、EGF、Noggin；或添加相關通路的抑制因子，如p53抑制劑Nut3，以篩選發生相應突變的類器官并鑒定突變基因。例如，如果Wnt通路激活的基因突變已經在類器官中自發出現，那么即便剝奪培養基中的Wnt生長因子，該類器官的生長也不會受到影響；反之，未發生該突變的類器官則會死亡。

腫瘤抑制蛋白APC是Wnt/β-cantenin經典信號通路的負調節因子。在CIN型CRC中，當APC突變失活時，β-cantenin積累、穩定性增加，Wnt通路被激活，繼而誘導腫瘤的生長和分化。此前實驗中，研究團隊已確認，通過在CIN型類器官培養基中去除Wnt-3a和Wnt激活劑R-spondin 1（即-WR培養基），可篩選出APC失活的類器官。本實驗中，研究人員利用相同的思路，使用-WR培養基篩選MLH1^KO類器官自發積累的突變，最終得到致密且出芽的結構。

圖2：-WR培養基篩選

（來源：參考資料[3]）

在同樣的抑制或激活干細胞生態位關鍵通路的培養基中，EGF、BMP和p53通路的篩選均未獲取可長期擴增的細胞系，表明在腺瘤-癌序列中，Wnt通路突變必須優先發生。

圖3：Wnt通路突變優先發生

（來源：參考資料[3]）

全基因組測序（WGS）分析發現了兩個復合雜合AXIN1突變和一個同源AXIN2突變。這與此前報道的AXIN1和AXIN2雙等位基因功能喪失突變可以激活Wnt通路并誘導CRC生長和增殖的結論吻合。研究者隨后將AXIN突變亞克隆類器官與APC^KO類器官對比，并進行了RT-qPCR分析，確認MLH1^KO類器官可作為體外篩查d-MMR缺陷突變基因的平臺，其自發突變可用于模擬體外癌癥的演化過程。

在Wnt通路突變的基礎上，研究人員展開第二輪篩選。結果發現，去除并抑制EGF的培養基中幾乎沒有類器官存活。而添加了Nutlins-3的培養基中，只有一個類器官存活并出芽。值得注意的是，添加了BMP通路抑制劑Noggin的培養基有大量類器官存活。

Nutlins-3是蛋白質p53抑制劑。p53也被稱作“抑癌蛋白”，當其編碼基因TP53突變時，細胞向腫瘤細胞發展。全外顯子組測序以及Sanger測序均顯示，Nutlins-3挑出的亞克隆類器官中存在TP53的錯義突變。

圖4：第二次篩選，類器官生長幾乎不受Noggin影響，但受Nut3選擇

（來源：參考資料[3]）

骨形態發生蛋白BMP通路在大多數散發性CRC中失活。類器官培養時則添加抑制劑Noggin以防止類器官過早分化并促進干細胞自我更新。第二輪篩選中，非Noggin依賴的亞克隆類器官里發現了ACVR2A和BMPR2這兩類經典的突變，且在不同的亞克隆中，具體發生突變的點位有所差別。而散發性CRC BMP突變中最為常見的SMAD4突變卻未被發現。這與此前文章中報道的BMPR2突變與散發性CRC中SMAD4相互排斥的結論符合。

在Wnt和Nut選擇后的雙突變株系（MLH1^KO-1-WR-1+Nu-1）內進行第三次突變篩選，EGFR通路依舊無對應突變出現，通過−Noggin培養基獲得了篩選結果。與此前未發生p53突變的非Noggin依賴亞克隆類器官相比，該克隆不攜帶BMPR 2純合突變，ACVR2A的突變點位也有所區別。這一結果再次肯定了此前“ACVR2A突變是獲得Noggin非依賴性的主要原因，BMPR2起到協同作用”的報道。

圖5：第三次篩選

（來源：參考資料[3]）

表皮生長因子（EGF）與其受體EGFR結合后，可激活Ras到Raf等一系列通路并影響細胞增殖和細胞周期。在此前的早期選擇實驗中，均未發現攜帶EGFR通路突變的亞克隆類器官，研究人員遂在已有的三通路突變的基礎之上（MLH1KO-1−WR-1+Nu−N），延長培養時間至300天，在積累更多的突變之后再次進行了選擇。

通過向培養基中添加EGFR抑制劑阿法替尼（Afa）和吉非替尼（Gef），最終篩選出RAS突變。RAS基因包含NRAS、HRAS和KRAS，是最常見的致癌基因之一。相較而言，微衛星低度不穩定（MSI-L）內KRAS突變更常見，而NRAS在所有MSI腫瘤中均頻繁發生。在本次篩選得到的亞克隆類器官中，發現NRAS雜合體細胞發生已知Ras和Raf通路的致癌突變。

圖6：EGFR通路篩選

（來源：參考資料[3]）

至此，研究人員構筑起了具有時序性的四通路突變體類器官。在類器官發育過程中，依次發生AXIN1和AXIN2（激活Wnt通路）、TP53（p53失活）、ACVR2A和BMPR2（BMP通路抑制）以及NRAS（激活Ras和Raf通路）突變，使類器官獲得MSI-H狀態，獨立于一系列生長因子，擁有轉化為腫瘤細胞的潛能。在不同克隆中獨立觀察到相同突變的獲得，也證明這些突變的獨立出現。

圖7：由MLH1^KO-1單個類器官克隆產生的所選突變體克隆的時間尺度遺傳樹

（來源：參考資料[3]）

研究人員構建無NRAS突變的三通路突變體類器官（KRAS^WT）以及四通路突變體（NRAS^Q61K）等一系列模型，并將其皮下注射到免疫缺陷的小鼠體內。8周的培養后，相較于三通路突變體，四通路突變體克隆具有更高的腫瘤形成率，更大的腫瘤大小，和更高的血管化程度。組織學分析也證實，四通路突變體類器官在異種移植后形成惡性腫瘤。

該結果不僅論證了NRAS突變對于腺瘤-癌序列發展的必要性，也再次表明，自發的四通路突變類器官保留了腺瘤-癌序列發展的能力，是忠實可靠的體外研究模型。

圖8：異種移植后8周時異種移植物的腫瘤尺寸

（來源：參考資料[3]）

在此前的實驗中，研究團隊已經證實MLH1^KO類器官可短期在體外重現d-MMR腫瘤的突變特征。本研究將此結論進一步解析，通過連續剝奪或添加生長因子篩選導致CRC發生的突變。在近1年的長期體外培養實驗中，證明CRC發生的第一步突變為AXIN1和AXIN2突變引起的Wnt通路激活，緊隨其后的是TP53、BMP通路和EGFR通路的突變。所有結論都證實，MLH1^KO類器官可作為MSI-H腫瘤發生的體外模型。且最終篩選得到的四通路突變體克隆皮下移植后也在小鼠體內致癌。

不過，考慮到腫瘤上皮類器官只能評價純上皮細胞組分，該系統報道腫瘤微環境和免疫應答的能力有限。且囿于近1年的研究時長和規模限制，實驗尚無法兼顧檢驗突變及突變獲得順序的不同組合。研究人員也提到，鑒于CRC的特殊性方便了四種突變通路的選擇，目前的MLH1^KO類器官模型或難以推廣到替他腫瘤類型中。

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