結(jié)直腸癌（CRC）是全球第二大致死性癌癥，從基因組層面而言主要由染色體不穩(wěn)定性（CIN）或微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）引起。MSI指當(dāng)基因錯(cuò)配修復(fù)功能（MMR）受損時(shí)，DNA復(fù)制過(guò)程中的堿基錯(cuò)配大量積累的現(xiàn)象，因而也被稱(chēng)為錯(cuò)配修復(fù)缺陷（d-MMR）。驅(qū)動(dòng)兩種基因組不穩(wěn)定性的突變不同：CIN由APC、TP53、KRAS、SMAD4和PIK3CA突變引起；MSI型CRC則與AXIN1、AXIN2、ACVR2A、TGFBR2、BMPR2和BRAF突變緊密相關(guān)。
1990年，美國(guó)科學(xué)院院士Vogelstein和Fearon教授提出Vogelgram模型[1]，描述了CRC腺瘤-癌癥序列發(fā)展進(jìn)程同遺傳及基因組變化之間的聯(lián)系（圖1）。不過(guò)，考慮到CRC整個(gè)癌變過(guò)程往往歷時(shí)數(shù)十年，其腺瘤-癌癥序列難以在體外被完整捕捉，真實(shí)可靠的體外模型尤其匱乏。
圖1：結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的遺傳模型Vogelgram
（來(lái)源：參考資料[2]）
2024年11月1日，荷蘭烏特勒支大學(xué)Hans Clevers教授團(tuán)隊(duì)在期刊Nature Cancer發(fā)表了題為“Recapitulating the adenoma–carcinoma sequence by selection of four spontaneous oncogenic mutations in mismatch-repair-deficient human colon organoids”的研究論文，首次基于類(lèi)器官模型在體外跟蹤描述了CRC腺瘤-癌序列發(fā)展中涉及到的四種關(guān)鍵信號(hào)通路突變。研究證明，這些突變中Wnt通路首先發(fā)生，p53、BMP通路及EGFR通路緊隨其后，相應(yīng)的突變基因及點(diǎn)位得到闡述。通過(guò)生長(zhǎng)因子的連續(xù)剝奪和添加，本研究成功篩選出自發(fā)突變的腫瘤類(lèi)器官，并在移植小鼠后于體內(nèi)成功誘導(dǎo)CRC發(fā)生，再次強(qiáng)調(diào)了該平臺(tái)作為體外腺瘤-癌序列發(fā)展研究模型的可靠性。
（來(lái)源：參考資料[3]）
01 d-MMR類(lèi)器官模型建立
Wnt、EGFR、BMP、p53等通路的激活或抑制已被證明與MMR缺陷型（d-MMR）CRC的腺瘤-癌序列的演進(jìn)緊密相關(guān)。為了在體外解碼其背后的基因突變機(jī)理，研究人員選擇了類(lèi)器官模型MLH1KO。此模型通過(guò)敲除（KO）MLH1基因，可于體外短期培養(yǎng)中重現(xiàn)d-MMR型CRC突變特征。
本研究中，MLH1KO在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)并積累了大量的自發(fā)突變。研究人員通過(guò)在培養(yǎng)基中獨(dú)立地去除相關(guān)通路的生長(zhǎng)因子，如Wnt、R-spondin 1、EGF、Noggin；或添加相關(guān)通路的抑制因子，如p53抑制劑Nut3，以篩選發(fā)生相應(yīng)突變的類(lèi)器官并鑒定突變基因。例如，如果Wnt通路激活的基因突變已經(jīng)在類(lèi)器官中自發(fā)出現(xiàn)，那么即便剝奪培養(yǎng)基中的Wnt生長(zhǎng)因子，該類(lèi)器官的生長(zhǎng)也不會(huì)受到影響；反之，未發(fā)生該突變的類(lèi)器官則會(huì)死亡。
02 Wnt通路突變
腫瘤抑制蛋白APC是Wnt/β-cantenin經(jīng)典信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子。在CIN型CRC中，當(dāng)APC突變失活時(shí)，β-cantenin積累、穩(wěn)定性增加，Wnt通路被激活，繼而誘導(dǎo)腫瘤的生長(zhǎng)和分化。此前實(shí)驗(yàn)中，研究團(tuán)隊(duì)已確認(rèn)，通過(guò)在CIN型類(lèi)器官培養(yǎng)基中去除Wnt-3a和Wnt激活劑R-spondin 1（即-WR培養(yǎng)基），可篩選出APC失活的類(lèi)器官。本實(shí)驗(yàn)中，研究人員利用相同的思路，使用-WR培養(yǎng)基篩選MLH1KO類(lèi)器官自發(fā)積累的突變，最終得到致密且出芽的結(jié)構(gòu)。
圖2：-WR培養(yǎng)基篩選
（來(lái)源：參考資料[3]）
在同樣的抑制或激活干細(xì)胞生態(tài)位關(guān)鍵通路的培養(yǎng)基中，EGF、BMP和p53通路的篩選均未獲取可長(zhǎng)期擴(kuò)增的細(xì)胞系，表明在腺瘤-癌序列中，Wnt通路突變必須優(yōu)先發(fā)生。
圖3：Wnt通路突變優(yōu)先發(fā)生
（來(lái)源：參考資料[3]）
全基因組測(cè)序（WGS）分析發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)復(fù)合雜合AXIN1突變和一個(gè)同源AXIN2突變。這與此前報(bào)道的AXIN1和AXIN2雙等位基因功能喪失突變可以激活Wnt通路并誘導(dǎo)CRC生長(zhǎng)和增殖的結(jié)論吻合。研究者隨后將AXIN突變亞克隆類(lèi)器官與APCKO類(lèi)器官對(duì)比，并進(jìn)行了RT-qPCR分析，確認(rèn)MLH1KO類(lèi)器官可作為體外篩查d-MMR缺陷突變基因的平臺(tái)，其自發(fā)突變可用于模擬體外癌癥的演化過(guò)程。
03 p53及BMP通路突變
在Wnt通路突變的基礎(chǔ)上，研究人員展開(kāi)第二輪篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，去除并抑制EGF的培養(yǎng)基中幾乎沒(méi)有類(lèi)器官存活。而添加了Nutlins-3的培養(yǎng)基中，只有一個(gè)類(lèi)器官存活并出芽。值得注意的是，添加了BMP通路抑制劑Noggin的培養(yǎng)基有大量類(lèi)器官存活。
Nutlins-3是蛋白質(zhì)p53抑制劑。p53也被稱(chēng)作“抑癌蛋白”，當(dāng)其編碼基因TP53突變時(shí)，細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞發(fā)展。全外顯子組測(cè)序以及Sanger測(cè)序均顯示，Nutlins-3挑出的亞克隆類(lèi)器官中存在TP53的錯(cuò)義突變。
圖4：第二次篩選，類(lèi)器官生長(zhǎng)幾乎不受Noggin影響，但受Nut3選擇
（來(lái)源：參考資料[3]）
骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP通路在大多數(shù)散發(fā)性CRC中失活。類(lèi)器官培養(yǎng)時(shí)則添加抑制劑Noggin以防止類(lèi)器官過(guò)早分化并促進(jìn)干細(xì)胞自我更新。第二輪篩選中，非Noggin依賴(lài)的亞克隆類(lèi)器官里發(fā)現(xiàn)了ACVR2A和BMPR2這兩類(lèi)經(jīng)典的突變，且在不同的亞克隆中，具體發(fā)生突變的點(diǎn)位有所差別。而散發(fā)性CRC BMP突變中最為常見(jiàn)的SMAD4突變卻未被發(fā)現(xiàn)。這與此前文章中報(bào)道的BMPR2突變與散發(fā)性CRC中SMAD4相互排斥的結(jié)論符合。
在Wnt和Nut選擇后的雙突變株系（MLH1KO-1-WR-1+Nu-1）內(nèi)進(jìn)行第三次突變篩選，EGFR通路依舊無(wú)對(duì)應(yīng)突變出現(xiàn)，通過(guò)−Noggin培養(yǎng)基獲得了篩選結(jié)果。與此前未發(fā)生p53突變的非Noggin依賴(lài)亞克隆類(lèi)器官相比，該克隆不攜帶BMPR 2純合突變，ACVR2A的突變點(diǎn)位也有所區(qū)別。這一結(jié)果再次肯定了此前“ACVR2A突變是獲得Noggin非依賴(lài)性的主要原因，BMPR2起到協(xié)同作用”的報(bào)道。
圖5：第三次篩選
（來(lái)源：參考資料[3]）
04 EGFR通路突變
表皮生長(zhǎng)因子（EGF）與其受體EGFR結(jié)合后，可激活Ras到Raf等一系列通路并影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期。在此前的早期選擇實(shí)驗(yàn)中，均未發(fā)現(xiàn)攜帶EGFR通路突變的亞克隆類(lèi)器官，研究人員遂在已有的三通路突變的基礎(chǔ)之上（MLH1KO-1−WR-1+Nu−N），延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至300天，在積累更多的突變之后再次進(jìn)行了選擇。
通過(guò)向培養(yǎng)基中添加EGFR抑制劑阿法替尼（Afa）和吉非替尼（Gef），最終篩選出RAS突變。RAS基因包含NRAS、HRAS和KRAS，是最常見(jiàn)的致癌基因之一。相較而言，微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定（MSI-L）內(nèi)KRAS突變更常見(jiàn)，而NRAS在所有MSI腫瘤中均頻繁發(fā)生。在本次篩選得到的亞克隆類(lèi)器官中，發(fā)現(xiàn)NRAS雜合體細(xì)胞發(fā)生已知Ras和Raf通路的致癌突變。
圖6：EGFR通路篩選
（來(lái)源：參考資料[3]）
至此，研究人員構(gòu)筑起了具有時(shí)序性的四通路突變體類(lèi)器官。在類(lèi)器官發(fā)育過(guò)程中，依次發(fā)生AXIN1和AXIN2（激活Wnt通路）、TP53（p53失活）、ACVR2A和BMPR2（BMP通路抑制）以及NRAS（激活Ras和Raf通路）突變，使類(lèi)器官獲得MSI-H狀態(tài)，獨(dú)立于一系列生長(zhǎng)因子，擁有轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞的潛能。在不同克隆中獨(dú)立觀察到相同突變的獲得，也證明這些突變的獨(dú)立出現(xiàn)。
圖7：由MLH1KO-1單個(gè)類(lèi)器官克隆產(chǎn)生的所選突變體克隆的時(shí)間尺度遺傳樹(shù)
（來(lái)源：參考資料[3]）
05 異種移植證明體內(nèi)可致癌
研究人員構(gòu)建無(wú)NRAS突變的三通路突變體類(lèi)器官（KRASWT）以及四通路突變體（NRASQ61K）等一系列模型，并將其皮下注射到免疫缺陷的小鼠體內(nèi)。8周的培養(yǎng)后，相較于三通路突變體，四通路突變體克隆具有更高的腫瘤形成率，更大的腫瘤大小，和更高的血管化程度。組織學(xué)分析也證實(shí)，四通路突變體類(lèi)器官在異種移植后形成惡性腫瘤。
該結(jié)果不僅論證了NRAS突變對(duì)于腺瘤-癌序列發(fā)展的必要性，也再次表明，自發(fā)的四通路突變類(lèi)器官保留了腺瘤-癌序列發(fā)展的能力，是忠實(shí)可靠的體外研究模型。
圖8：異種移植后8周時(shí)異種移植物的腫瘤尺寸
（來(lái)源：參考資料[3]）
06 總結(jié)與展望
在此前的實(shí)驗(yàn)中，研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)證實(shí)MLH1KO類(lèi)器官可短期在體外重現(xiàn)d-MMR腫瘤的突變特征。本研究將此結(jié)論進(jìn)一步解析，通過(guò)連續(xù)剝奪或添加生長(zhǎng)因子篩選導(dǎo)致CRC發(fā)生的突變。在近1年的長(zhǎng)期體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，證明CRC發(fā)生的第一步突變?yōu)锳XIN1和AXIN2突變引起的Wnt通路激活，緊隨其后的是TP53、BMP通路和EGFR通路的突變。所有結(jié)論都證實(shí)，MLH1KO類(lèi)器官可作為MSI-H腫瘤發(fā)生的體外模型。且最終篩選得到的四通路突變體克隆皮下移植后也在小鼠體內(nèi)致癌。
不過(guò)，考慮到腫瘤上皮類(lèi)器官只能評(píng)價(jià)純上皮細(xì)胞組分，該系統(tǒng)報(bào)道腫瘤微環(huán)境和免疫應(yīng)答的能力有限。且囿于近1年的研究時(shí)長(zhǎng)和規(guī)模限制，實(shí)驗(yàn)尚無(wú)法兼顧檢驗(yàn)突變及突變獲得順序的不同組合。研究人員也提到，鑒于CRC的特殊性方便了四種突變通路的選擇，目前的MLH1KO類(lèi)器官模型或難以推廣到替他腫瘤類(lèi)型中。
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參考資料
1. Fearon, E R, and B Vogelstein. “A genetic model for colorectal tumorigenesis.” Cell vol. 61,5 (1990): 759-67. doi:10.1016/0092-8674(90)90186-i
2. Menter, David G et al. “Back to the Colorectal Cancer Consensus Molecular Subtype Future.” Current gastroenterology reports vol. 21,2 5. 30 Jan. 2019, doi:10.1007/s11894-019-0674-9
3. Mizutani, Tomohiro et al. “Recapitulating the adenoma-carcinoma sequence by selection of four spontaneous oncogenic mutations in mismatch-repair-deficient human colon organoids.” Nature cancer, 10.1038/s43018-024-00841-x. 1 Nov. 2024, doi:10.1038/s43018-024-00841-x