牙齒由上皮和間充質細胞間的相互作用發生（圖1），通過胚胎牙上皮和間充質干細胞已可以功能性重建和再生牙齒，使牙齒的原位全器官置換成為可能。然而人類牙齒萌出后上皮干細胞數量缺失，導致使用上皮干細胞進行牙齒修復極為困難，牙齒再生機制研究模型的發展也受到限制。

圖1：牙齒的發育過程及關鍵信號通路

（來源：參考資料[1]）

牙齒類器官因具有與牙齒類似的結構和一致的功能，已經成為體外研究牙齒發育的重點模型。2023年的兩項研究通過人類誘導多能干細胞（hiPSC）成功構建了人類成釉細胞（負責產生和分泌牙釉質）類器官。該模型可與牙間充質相互作用形成牙釉質以進行鈣化和礦化，并具有成牙分化潛能[2,3]。

小鼠牙上皮干細胞在整個生命過程中維持存續，且由于哺乳動物的牙齒發育相關信號具有高度類似性，已成為主要的牙齒發育研究模型。然而，在常用的胎牛血清（FBS）培養基中無法準確定義生長因子及代謝物對牙齒發育的意義。比利時科學家基于小鼠上皮干細胞開發了可長期培養的牙齒類器官，并驗證了無血清培養體系的可行性[4]。不同于hiPSC發展的類器官模型僅停留在上皮來源的成釉細胞階段，小鼠牙齒類器官覆蓋了成釉細胞和間充質來源的成牙本質細胞兩類細胞的相互作用，有助于探索牙齒礦化及重建的分子基礎。

2024年11月27日，四川大學李中瀚教授課題組在期刊Advanced Science上發表題為“A chemically defined culture for tooth reconstitution” 的研究論文。本研究在確定成分的無血清化學培養基上進行了小鼠來源牙齒類器官的重建，并依據此模型，發現牙齒重建并不重置發育時鐘。研究團隊隨后在氣-液界面上通過Activin A和SHH途徑激動劑SAG的持續共刺激進一步激發了早期體外類器官的發育潛力，并揭示了骨形態發生蛋白BMP誘導牙釉質形成的重要作用。該研究優化了模擬牙齒重建的體外類器官模型的培養條件，對未來的牙齒發育機制研究與再生移植具有重要意義。

（來源：參考資料[4]）

研究團隊從不同發育階段的小鼠牙胚中分離原代上皮和間充質細胞，發現與FBS培養基類似，牙齒培養物在無血清化學培養基上也能夠持續成長，并同樣出現了由間充質細胞包圍的多個上皮細胞團和牙胚樣結構。

接下來，移植獲得的牙齒類器官至腎被膜下，發現胚胎來源的類器官均可形成牙狀體結構，且解剖結構與PN7（胎兒第7天）的M1臼齒類似。定量分析結果顯示，多個胚胎階段的原代細胞可以在無血清化學培養基中重建牙狀體，這種能力在出生后消失。

圖2：不同階段細胞分化為牙齒類器官的能力對比

（來源：參考資料[4]）

比起臼齒而言，相同培養系統培養的切齒類器官中產生的牙齒數量更少，而生成的牙狀體結構更大，且E18.5及更晚期來源的切齒牙胚不具有發育成切齒的能力。這表示切齒比臼齒發育更快，并更早地失去重建分化的潛力。

研究人員發現，E14.5牙齒類器官中，發育標記如間充質祖細胞Msx1⁺Sox9⁺的發育軌跡和SDC1的動態表達模式均類似于天然M1臼齒。稍有差異的是，原發釉結（牙發育的組織中心）在培養第4-10天內發生，但繼發釉結始終未檢出，可能是自組織牙胚的尺寸限制導致了這一現象。

圖3：牙齒類器官的發育鑒定

（來源：參考資料[4]）

繼續培養牙齒類器官至第24天，scRNA-seq數據分析發現了多種階段特異性牙齒標記物的時序性表達。除E14.5外，來自多個其他階段的牙齒類器官也可以持續發育并產生成熟牙齒細胞的譜系。

圖4：類器官中牙齒標記物的時序性表達

（來源：參考資料[4]）

此外，研究人員通過抑制關鍵信號通路發現，牙齒類器官也會響應其化學調節。當抑制ALK5時，類器官中牙齒形成減少；阻斷Wnt會抑制牙齒形成并增加表皮化；而激活Wnt信號傳導會誘導多個牙本質-牙髓復合體和牙釉質樣結構的形成。

圖5：牙齒類器官中的信號通路的調控

（來源：參考資料[4]）

綜上所述，化學培養基中獲得的牙齒類器官可以重現正常的牙齒發育過程，并擁有與正常牙齒發生類似的關鍵信號通路，可作為發育和重建機理的研究模型。

以此牙齒類器官為模型，研究人員很快發現，牙齒發育不同階段的標志物僅在各階段特異性表達，晚期階段均未檢出早期階段的標志物，這意味著牙齒重建并不是通過重置發育時鐘的方式進行。

雖然E12.5及之后階段的牙胚可以通過化學培養基及移植獲得牙齒結構，但早期牙胚誘導牙齒形成的能力保持不長久。為改良這一問題，研究人員探索了牙齒發育的早期重要信號Activin A，促進上皮細胞增殖和侵襲所必需的SHH信號，以及上文已經提及的Wnt信號的刺激作用。

結果發現，三種信號刺激可以誘導牙齒的生成，且當Activin A和SAG（SHH途徑激動劑）加入培養基后，原代組織發育形成牙齒的數目最多。此外，Activin A和SAG的持續共刺激有助于在體外牙齒類器官培養期間保持發育潛力。

圖6：多重關鍵通路刺激誘導初期牙胚的牙齒重建

（來源：參考資料[4]）

為此，研究人員將類器官轉移到氣-液界面用于進一步誘導，然而牙釉質卻并沒有生成。研究團隊發現，抑制BMP信號會強烈抑制牙釉質誘導且該過程呈劑量依賴性。單獨激活BMP信號可促進牙釉質生成。除此以外，TGF-β1激活劑也可協同增強牙釉質的形成。

圖7：BMP誘導牙釉質生成

（來源：參考資料[4]）

本研究中，多個胚胎階段的牙胚細胞可在化學無血清培養基上生成牙齒類器官，并在移植腎被膜下后發育成臼齒或切齒樣結構。該類器官模型與牙齒具有一致的發育特征，且關鍵信號通路保守，可用于體外研究牙齒重建的機制?；诖?，研究人員隨后發現，牙齒重建并不重置發育時鐘，原代細胞從最初剝離的階段繼續開始發育。此外，研究人員還探索了刺激早期牙胚發育的因素，發現Activin A和SAG的共刺激至關重要，而BMP/TGF-β信號的激活是成釉細胞分泌細胞外基質和形成成熟牙釉質組織的關鍵觸發因素。

不過，目前為止的牙齒類器官仍依賴于原代細胞而非多能干細胞，難以長期保持增殖狀態，此外，也無法體外誘導牙根發育（盡管保留有牙根發育的全部潛力）。研究人員指出，微環境的信號可能對體外誘導至關重要，而牙齒類器官與神經嵴細胞結合或可進一步助力在體外產生完全發育的牙齒。未來在這些方面的探索，將進一步助力對牙齒重建機制的深入了解，推進人類牙齒臨床替代的更多可能。

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