IF=6.2！首醫大牛丕業教授團隊破譯錳神經毒性奧秘：鐵死亡通路成關鍵“突破口”

英文標題：Multi-omics analysis reveals Mn exposure affects ferroptosis pathway in zebrafish brain

中文標題：多組學分析揭示錳暴露對斑馬魚大腦鐵死亡途徑的影響

發表期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety

影響因子：6.1

客戶單位：首都醫科大學

百趣提供服務：新一代代謝組學NGM 2 Pro
 

研究背景

錳(Mn)是人體必需的微量元素，同時也是一種廣泛存在的職業性毒物和環境污染物。中樞神經系統中過量的Mn積累會導致神經功能障礙，毒理學研究已證實，Mn可引發多種不良效應，包括發育毒性、心血管毒性、肝毒性、腎毒性及免疫毒性等。其中，Mn的神經毒性尤為受關注，因其可穿過血腦屏障并在腦內蓄積。既往研究表明，Mn誘導神經毒性的部分機制涉及氧化應激、代謝異常、神經炎癥及細胞凋亡等，但由于大腦細胞存在組成復雜性和異質性，在單細胞水平上對Mn誘導神經毒性的分子機制研究仍較為有限。本研究采用單細胞測序技術(scRNA-seq)篩選出斑馬魚大腦中在Mn暴露下受影響顯著且在神經毒性過程中起關鍵作用的神經元類型，并結合基因表達譜和非靶標代謝組學研究Mn對斑馬魚神經毒性的機制。
 

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研究結果

1、錳暴露后斑馬魚腦單細胞圖譜的構建

為了更好地了解Mn暴露對斑馬魚腦中不同細胞類型的影響，研究者繪制了斑馬魚大腦在不同Mn暴露水平（對照組、低暴露組、高暴露組）下的單細胞圖譜。通過分析共鑒定了21個細胞簇（圖1A），并通過標記基因鑒定了10種細胞類型：膽堿能神經元、DA神經元（多巴胺能神經元）、谷氨酸能神經元、GABA能神經元、神經元前體、其他神經元、小膠質細胞、少突膠質細胞、放射狀膠質細胞和未定義細胞。圖1C可視化了每個細胞簇中標記基因的表達情況，圖1D顯示了各組中細胞類型的占比情況。與對照組相比，低暴露組中膽堿能神經元的比例增加0.347%，但在高暴露組中減少了3.405%；DA神經元在低暴露組中增加了0.251%，但在高暴露組中減少了1.186%；GAB能神經元在低暴露組和高暴露組中分別顯著增加了4.449%和3.373%。這些結果表明，Mn暴露可以改變膽堿能神經元、DA神經元和GABA能神經元的細胞類型比例。

圖1. 斑馬魚腦的單細胞圖譜

2、錳暴露對斑馬魚腦神經元類型分化軌跡的影響

神經元是大腦接收、整合、傳導和傳遞信息的基本結構和功能單位。因此，研究者對不同亞型的神經元進行了進一步分析，獲得了12個并列的細胞簇（圖2A）。值得注意的是，膽堿能神經元、DA神經元、谷氨酸能神經元和GABA能神經元這四種主要神經元類型，在這些亞簇中呈現獨立的分布模式。通過擬時序分析將不同表達水平的基因按軌跡進行排序，結果顯示，隨著Mn暴露劑量的增加，神經元逐漸趨向軌跡的末端，這在一定程度上驗證了所構建軌跡的合理性。

進一步將擬時序分析結果與細胞類型結果比對發現，對照組中以DA神經元和膽堿能神經元為主導，而Mn暴露后，神經元類型的主導模式呈現明顯動態變化，依次轉變為以GABA能神經元、谷氨酸能神經元和未定義的中間態神經元為主導。

基于擬時序分析，將表達水平發生顯著變化的基因劃分為三個功能模塊（圖2C）。下調基因主要富集于核糖核蛋白復合體生物合成、蛋白質折疊、細胞代謝過程、G蛋白偶聯受體信號通路及對溫度刺激的響應等過程，其中281個下調基因與細胞代謝功能密切相關（簇1）；上調基因模塊（簇2）顯著富集于ATP代謝過程、大分子生物合成調控、G蛋白偶聯受體活性、晝夜節律調控及電子傳遞鏈相關通路；簇3的模塊代表基因表達變化的中間狀態，可能反映神經元類型轉換的動態過程。綜上結果表明，Mn暴露不僅促使神經元類型主導模式從DA神經元向GABA能神經元轉變，還動態調控了與細胞代謝相關的基因表達程序，進而影響神經元的功能狀態。

圖2. 聚類和擬時序分析識別斑馬魚腦神經元細胞的轉錄動態變化

3、多組學聯合分析錳對斑馬魚腦神經元鐵死亡信號通路的破壞作用

為了探討錳神經毒性的轉錄調控機制和代謝組學途徑，研究首先對Mn暴露后神經元中的差異表達基因(DEGs)進行了鑒定分析。在低暴露組中，谷氨酸能神經元中有289個DEGs，DA神經元中有170個，GABA能神經元中有49個，膽堿能神經元中有27個（圖3A）。在高暴露組中，所有類型的細胞中觀察到更多的DEGs，其中多巴胺神經元中有413個DEGs，谷氨酸能神經元中有141個，GABA能神經元中有107個，膽堿能神經元中有66個（圖3B）。

采用非靶標代謝組學鑒定代謝物變化（圖3C-D），在低暴露組中檢測到66個差異代謝物(DEMs)，在高暴露組中檢測到63個DEMs（圖3E-F）。

圖3. 錳暴露后斑馬魚腦的轉錄組學變化與代謝重編程

由于Mn暴露顯著影響神經元的轉錄組和代謝組，研究者進一步對神經元中DEGs和DEMs富集的代謝通路進行了聯合分析（圖4A-B）。代謝途徑表明，Mn對細胞代謝途徑的影響隨Mn劑量的增加而顯著改變。在低暴露和高暴露組中，甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、谷胱甘肽代謝以及精氨酸和脯氨酸代謝在多種細胞類型中富集。Mn影響參與脂質代謝、氨基酸代謝和葡萄糖代謝途徑的代謝物水平，特別是在DA神經元中。通過KEGG信號通路分析進一步探索Mn暴露后神經元代謝通路涉及的信號通路。結果顯示，在高暴露組中，膽堿能神經元有62條富集通路， GABA能神經元有43條富集通路。在高暴露組中富集的134條DA神經元通路中，發現鐵死亡通路包含12個DEGs和3個DEMs（圖4C）。在低暴露組中，鐵死亡通路中也有7個DEGs和3個DEMs富集。谷氨酸和GSSG的水平隨著Mn暴露劑量的增加而增加，而GSH則呈劑量依賴性下降趨勢。在DA神經元中，基因hmox1b的表達在Mn暴露后顯著升高。與此同時，gpx4a、slc40a1和sat1a.2的表達與Mn濃度成反比下降。此外，acsl2、gclc、slc3a2b、ncoa4和map1lc3cl的表達僅在高暴露組中顯著下降。同時，在其他神經元中，沒有觀察到Mn暴露后鐵死亡相關基因表達的顯著差異。

圖4. 多組學聯合分析錳對斑馬魚腦神經元鐵死亡信號通路的影響

研究結論

該研究構建了成年斑馬魚慢性Mn暴露模型，繪制了斑馬魚腦單細胞圖譜，并在單細胞水平上研究了Mn暴露后斑馬魚神經元的轉錄組學特征。非靶標代謝組學的結果揭示了Mn暴露下斑馬魚腦的代謝重編程。本文通過多組學的聯合分析，發現Mn暴露破壞了斑馬魚DA神經元中的鐵死亡信號傳導通路，從而揭示了鐵死亡途徑是Mn致神經毒性的新型潛在機制。

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劉華岐 撰文

Tang 校稿