IF=6.2！首醫(yī)大牛丕業(yè)教授團隊破譯錳神經(jīng)毒性奧秘：鐵死亡通路成關(guān)鍵“突破口”
英文標(biāo)題：Multi-omics analysis reveals Mn exposure affects ferroptosis pathway in zebrafish brain
中文標(biāo)題：多組學(xué)分析揭示錳暴露對斑馬魚大腦鐵死亡途徑的影響
發(fā)表期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety
影響因子：6.1
客戶單位：首都醫(yī)科大學(xué)
百趣提供服務(wù)：新一代代謝組學(xué)NGM 2 Pro
研究背景
錳(Mn)是人體必需的微量元素，同時也是一種廣泛存在的職業(yè)性毒物和環(huán)境污染物。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中過量的Mn積累會導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，毒理學(xué)研究已證實，Mn可引發(fā)多種不良效應(yīng)，包括發(fā)育毒性、心血管毒性、肝毒性、腎毒性及免疫毒性等。其中，Mn的神經(jīng)毒性尤為受關(guān)注，因其可穿過血腦屏障并在腦內(nèi)蓄積。既往研究表明，Mn誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的部分機制涉及氧化應(yīng)激、代謝異常、神經(jīng)炎癥及細胞凋亡等，但由于大腦細胞存在組成復(fù)雜性和異質(zhì)性，在單細胞水平上對Mn誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的分子機制研究仍較為有限。本研究采用單細胞測序技術(shù)(scRNA-seq)篩選出斑馬魚大腦中在Mn暴露下受影響顯著且在神經(jīng)毒性過程中起關(guān)鍵作用的神經(jīng)元類型，并結(jié)合基因表達譜和非靶標(biāo)代謝組學(xué)研究Mn對斑馬魚神經(jīng)毒性的機制。
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研究結(jié)果
1、錳暴露后斑馬魚腦單細胞圖譜的構(gòu)建
為了更好地了解Mn暴露對斑馬魚腦中不同細胞類型的影響，研究者繪制了斑馬魚大腦在不同Mn暴露水平（對照組、低暴露組、高暴露組）下的單細胞圖譜。通過分析共鑒定了21個細胞簇（圖1A），并通過標(biāo)記基因鑒定了10種細胞類型：膽堿能神經(jīng)元、DA神經(jīng)元（多巴胺能神經(jīng)元）、谷氨酸能神經(jīng)元、GABA能神經(jīng)元、神經(jīng)元前體、其他神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、放射狀膠質(zhì)細胞和未定義細胞。圖1C可視化了每個細胞簇中標(biāo)記基因的表達情況，圖1D顯示了各組中細胞類型的占比情況。與對照組相比，低暴露組中膽堿能神經(jīng)元的比例增加0.347%，但在高暴露組中減少了3.405%；DA神經(jīng)元在低暴露組中增加了0.251%，但在高暴露組中減少了1.186%；GAB能神經(jīng)元在低暴露組和高暴露組中分別顯著增加了4.449%和3.373%。這些結(jié)果表明，Mn暴露可以改變膽堿能神經(jīng)元、DA神經(jīng)元和GABA能神經(jīng)元的細胞類型比例。
圖1. 斑馬魚腦的單細胞圖譜
2、錳暴露對斑馬魚腦神經(jīng)元類型分化軌跡的影響
神經(jīng)元是大腦接收、整合、傳導(dǎo)和傳遞信息的基本結(jié)構(gòu)和功能單位。因此，研究者對不同亞型的神經(jīng)元進行了進一步分析，獲得了12個并列的細胞簇（圖2A）。值得注意的是，膽堿能神經(jīng)元、DA神經(jīng)元、谷氨酸能神經(jīng)元和GABA能神經(jīng)元這四種主要神經(jīng)元類型，在這些亞簇中呈現(xiàn)獨立的分布模式。通過擬時序分析將不同表達水平的基因按軌跡進行排序，結(jié)果顯示，隨著Mn暴露劑量的增加，神經(jīng)元逐漸趨向軌跡的末端，這在一定程度上驗證了所構(gòu)建軌跡的合理性。
進一步將擬時序分析結(jié)果與細胞類型結(jié)果比對發(fā)現(xiàn)，對照組中以DA神經(jīng)元和膽堿能神經(jīng)元為主導(dǎo)，而Mn暴露后，神經(jīng)元類型的主導(dǎo)模式呈現(xiàn)明顯動態(tài)變化，依次轉(zhuǎn)變?yōu)橐訥ABA能神經(jīng)元、谷氨酸能神經(jīng)元和未定義的中間態(tài)神經(jīng)元為主導(dǎo)。
基于擬時序分析，將表達水平發(fā)生顯著變化的基因劃分為三個功能模塊（圖2C）。下調(diào)基因主要富集于核糖核蛋白復(fù)合體生物合成、蛋白質(zhì)折疊、細胞代謝過程、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路及對溫度刺激的響應(yīng)等過程，其中281個下調(diào)基因與細胞代謝功能密切相關(guān)（簇1）；上調(diào)基因模塊（簇2）顯著富集于ATP代謝過程、大分子生物合成調(diào)控、G蛋白偶聯(lián)受體活性、晝夜節(jié)律調(diào)控及電子傳遞鏈相關(guān)通路；簇3的模塊代表基因表達變化的中間狀態(tài)，可能反映神經(jīng)元類型轉(zhuǎn)換的動態(tài)過程。綜上結(jié)果表明，Mn暴露不僅促使神經(jīng)元類型主導(dǎo)模式從DA神經(jīng)元向GABA能神經(jīng)元轉(zhuǎn)變，還動態(tài)調(diào)控了與細胞代謝相關(guān)的基因表達程序，進而影響神經(jīng)元的功能狀態(tài)。
圖2. 聚類和擬時序分析識別斑馬魚腦神經(jīng)元細胞的轉(zhuǎn)錄動態(tài)變化
3、多組學(xué)聯(lián)合分析錳對斑馬魚腦神經(jīng)元鐵死亡信號通路的破壞作用
為了探討錳神經(jīng)毒性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制和代謝組學(xué)途徑，研究首先對Mn暴露后神經(jīng)元中的差異表達基因(DEGs)進行了鑒定分析。在低暴露組中，谷氨酸能神經(jīng)元中有289個DEGs，DA神經(jīng)元中有170個，GABA能神經(jīng)元中有49個，膽堿能神經(jīng)元中有27個（圖3A）。在高暴露組中，所有類型的細胞中觀察到更多的DEGs，其中多巴胺神經(jīng)元中有413個DEGs，谷氨酸能神經(jīng)元中有141個，GABA能神經(jīng)元中有107個，膽堿能神經(jīng)元中有66個（圖3B）。
采用非靶標(biāo)代謝組學(xué)鑒定代謝物變化（圖3C-D），在低暴露組中檢測到66個差異代謝物(DEMs)，在高暴露組中檢測到63個DEMs（圖3E-F）。
圖3. 錳暴露后斑馬魚腦的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化與代謝重編程
由于Mn暴露顯著影響神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄組和代謝組，研究者進一步對神經(jīng)元中DEGs和DEMs富集的代謝通路進行了聯(lián)合分析（圖4A-B）。代謝途徑表明，Mn對細胞代謝途徑的影響隨Mn劑量的增加而顯著改變。在低暴露和高暴露組中，甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、谷胱甘肽代謝以及精氨酸和脯氨酸代謝在多種細胞類型中富集。Mn影響參與脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝和葡萄糖代謝途徑的代謝物水平，特別是在DA神經(jīng)元中。通過KEGG信號通路分析進一步探索Mn暴露后神經(jīng)元代謝通路涉及的信號通路。結(jié)果顯示，在高暴露組中，膽堿能神經(jīng)元有62條富集通路， GABA能神經(jīng)元有43條富集通路。在高暴露組中富集的134條DA神經(jīng)元通路中，發(fā)現(xiàn)鐵死亡通路包含12個DEGs和3個DEMs（圖4C）。在低暴露組中，鐵死亡通路中也有7個DEGs和3個DEMs富集。谷氨酸和GSSG的水平隨著Mn暴露劑量的增加而增加，而GSH則呈劑量依賴性下降趨勢。在DA神經(jīng)元中，基因hmox1b的表達在Mn暴露后顯著升高。與此同時，gpx4a、slc40a1和sat1a.2的表達與Mn濃度成反比下降。此外，acsl2、gclc、slc3a2b、ncoa4和map1lc3cl的表達僅在高暴露組中顯著下降。同時，在其他神經(jīng)元中，沒有觀察到Mn暴露后鐵死亡相關(guān)基因表達的顯著差異。
圖4. 多組學(xué)聯(lián)合分析錳對斑馬魚腦神經(jīng)元鐵死亡信號通路的影響
研究結(jié)論
該研究構(gòu)建了成年斑馬魚慢性Mn暴露模型，繪制了斑馬魚腦單細胞圖譜，并在單細胞水平上研究了Mn暴露后斑馬魚神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征。非靶標(biāo)代謝組學(xué)的結(jié)果揭示了Mn暴露下斑馬魚腦的代謝重編程。本文通過多組學(xué)的聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)Mn暴露破壞了斑馬魚DA神經(jīng)元中的鐵死亡信號傳導(dǎo)通路，從而揭示了鐵死亡途徑是Mn致神經(jīng)毒性的新型潛在機制。
新一代代謝組學(xué)NGM 2 Pro：憑借全球領(lǐng)先的2w+代謝物標(biāo)準(zhǔn)品自建庫，顯著改善代謝組學(xué)鑒定準(zhǔn)確性不足、數(shù)量有限的痛點。其基于LC-MS技術(shù)，可檢測生物受刺激后小分子代謝物動態(tài)變化，助力篩選差異代謝物并關(guān)聯(lián)生理病理。針對代謝物多樣性及提取局限，該技術(shù)通過多色譜柱聯(lián)用覆蓋非極性/極性代謝物與脂質(zhì)，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品自建庫進一步提升鑒定效率，為標(biāo)志物篩選、機制研究提供有力支撐。
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END
劉華岐 撰文
Tang 校稿
