IF=17.1！浙大孫崇德教授團隊解鎖柑橘“隱藏密碼”，小小果子憑啥兼具超強抗癌抗氧化力？快來看這顛覆性發現！

生物活性化合物在培育功能性及營養豐富的柑橘等水果作物中發揮著越來越重要的作用。然而，柑橘中生物活性化合物變異的選擇和分化背后的基因組和代謝基礎仍知之甚少。浙江大學果實品質生物學孫崇德教授團隊在Molecular Plant上發表了題為“Genomic and metabolomic insights into the selection and differentiation of bioactive compounds in citrus”的研究論文，旨在利用299個柑橘品系構建物種水平的基因組和代謝組變異圖譜，研究中共檢測到19,829個顯著單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)，涉及653種注釋代謝物，其中40種次級代謝物，特別是黃酮類化合物，被鑒定出多個顯著信號，這些結果闡明了46種具有優異抗氧化和抗癌能力的柑橘品種，明確了不同生物活性與特定代謝物之間的穩健關聯，為柑橘育種提供了48個選擇。

1.柑橘屬植物的系統發育和代謝關系

收集了來自不同國家和地區的299個柑橘品系進行基因組重測序，構建了所有299個樣本的最大系統發育樹，并分析了群體的結構（圖1A)?；?span id="njjnl7nllljl" class="wx_search_keyword_wrap" style="-webkit-tap-highlight-color: transparent; margin: 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important; color: var(--weui-link); cursor: default;">SNP的系統發育主成分分析(PCA)結果顯示，G-C和G-P可以分為兩個亞群（圖1B），表明柑橘群體具有全面的聚類特征；研究人員隨后基于LC-MS/MS構建了一個柑橘特異性代謝組庫，并對所有柑橘品系黃化層中的代謝物進行了定性和定量分析。主成分分析顯示了不同分組的聚集（圖1C），但次級代謝產物，特別是來自苯丙烷代謝途徑的黃酮類和香豆素，在七個組之間表現出明顯的模式（圖1D)。這些結果表明種屬早期分化，可能會導致各群體之間的代謝差異。

2.柑橘中生物活性化合物差異積累的基因組基礎

為了探討不同柑橘群體中黃酮類和香豆素類化合物背后的遺傳決定因素，研究人員比較了除G-O組外所有組中黃酮類和香豆素類合成途徑中代謝物的含量，結果發現，六個群體表現出不同的代謝物積累特征，特別是香豆素和黃酮類化合物（圖2A)，揭示了三種祖先物種對苯丙烷途徑不同分支的偏好；此外，三個祖先群體之間的Fst值較高（超過0.8)，表明高度分化（圖2B)；進一步研究發現，G-M和G-P-1中發現了大量參與黃酮和香豆素合成的結構基因，如C2‘H2、CYP76F46、FNS2、FNS3、F3’H和CYP82D92（圖2C)；此外，G-S和G-P-2是G-M和G-P-1的兩個雜交后代，其香豆素/黃酮類化合物的積累偏好與G-M相似，而G-P-2則與G-P-1相似（圖2A)，這些結果表明代謝物的積累偏好可能與相應親本祖先起源區域的比例有關。

3.通過mGWAS確定的代謝物相關位點景觀

為了探索柑橘群體間代謝差異相關的功能基因，共選擇了241,279個柑橘品系進行mGWAS分析，在鑒定出所有代謝物中，黃酮類化合物具有最多的顯著位點，廣泛分布在253條染色體上。此外，多種代謝物的顯著位點共定位主要出現在次級代謝物中，包括酚酸、木脂素和香豆素、黃酮類化合物以及255種生物堿（圖3）。

4.與柑橘中香豆素積累相關的候選基因

研究人員進一步搜索了所有香豆素的mGWAS信號，發現了一個由四個C2‘H基因串聯重復組成的基因簇，位于強峰的主SNP的50-100 kb區域，這是一種典型的呋喃香豆素，與補骨脂素相關（圖4A-B)；在這三個C2’H基因中，只有Ciclev10017914m在高含量補骨脂素的柑橘樣本中表達量高于低含量補骨脂素的樣本（圖4C)；研究人員對由288個Ciclev10018343m、Ciclev10017914m和Ciclev10015700m編碼的重組蛋白進行了體外酶活性測定，結果表明，這三種重組蛋白能夠分別催化產生傘形酮和芹菜素（圖4D)；在Chr7的15.73 Mb區域，研究人員觀察到四種呋喃香豆素含量的顯著關聯信號：異氧普卡寧、異阿莫林、異阿莫林和西尼地辛（圖4E)，這引導識別出該區域內的兩個候選基因，Ciclev10027371m和307 Ciclev10025349m；此外，觀察到Ciclev10027371m和Ciclev10025349m的表達水平與四種呋喃香豆素的量呈正相關（圖4F)；還發現補骨脂素是Ciclev10025349m的新底物，用于生成伯加普醇（圖4G)，這些結果強調了它們在協調呋喃香豆素合成中的潛在作用。

5.黃酮類化合物合成UGT的鑒定及功能表征

研究人員對兩個候選黃酮類進行鑒定，分別為Ciclev10015105m和Ciclev10019927m（圖5A和5B)；其中Ciclev10015105m和Ciclev10019927m位于7GT支系（圖5C)；G-P-1主要包含高代謝物含量的單倍型（圖5D）；核苷酸多樣性分析顯示，兩個候選UGTs 343在不同黃酮苷含量的柑橘類群中表現出顯著差異表達水平（圖5E)。

候選UGT349(Ciclev10019927m)上游270kb處存在一個bHLH轉錄因子（圖5B)，在果皮中瞬時過表達Ciclev10019339m顯著增加了總黃酮苷含量，表明其可能是一個與柑橘中黃酮類化合物合成調控相關的潛在bHLH轉錄因子；此外，當其作為重組蛋白時，可以催化九種底物的7-O-葡萄糖基（圖5F-5N)，以上結果表明，這兩個候選基因由于具有多種底物和催化位點，表現出多功能UGT特性。

6.柑橘生物活性功能的代謝組學基礎

研究人員使用來自219個品系的果皮提取物，評估這些柑橘品種的生物活性?？寡趸瘷z測實驗發現，沒有特別具有卓越綜合抗氧化能力的組（圖6A)；利用十種癌細胞進行抗癌實驗，結果顯示：不同組之間的抗癌能力存在顯著差異，具體如下：G-M>G-S≈G-P-2>G-P-1=G- 400 C=G-O（圖6B)；此外，研究人員還評估了柑橘提取物對人體內三種重要CYP450酶——CYP3A4、CYP2C9和CYP1A2的抑制能力，結果發現，與其他組相比，G-P-1和G-P-2表現出顯著的CYP450酶抑制能力（圖6C)。

研究人員進一步將生物活性評估結果整合到446個柑橘群體的進化路線圖中（圖6D)，結果表明，純柑橘、栽培柑橘、G-M中的唐桔和G-S中的甜橙表現出強大的抗氧化和抗癌能力，且對CYP450酶沒有顯著抑制作用，這使它們成為通過選擇性育種推進功能性藥用柑橘的首選，這些結論為功能性食品研究提供了理論依據。

在這項研究中，研究人員對現存柑橘物種的299個代表性品系進行了基因組重測序和代謝組學分析，提供了柑橘種群遺傳變異和代謝譜的全球圖景，揭示了在柑橘種群分化過程中，苯丙烷途徑差異選擇的遺傳基礎可能導致了不同生物活性化合物的特征合成；此外，還確定了與黃酮類和香豆素合成相關的候選基因；并驗證了顯著生物活性與生物活性化合物之間的關系，闡明了生物活性變化路徑及其與柑橘種群進化的關聯。這些結果有助于設計營養價值更高的柑橘品種，為促進柑橘類健康水果作物遺傳改良提供了有力依據。