端腦的神經活動主要由源自胚胎神經節隆起（GE）的皮質GABA能神經元和皮質下區GABA能神經元塑造。然而，由于神經元亞型高度復雜，人們對這些神經元分化的機制仍知之甚少。本研究結合單細胞RNA測序和基因功能缺失實驗，發現小鼠中Foxg1基因的缺失會導致皮質神經元分化為皮質下區神經元。解析了神經節隆起譜系的發育軌跡，揭示了FOXG1驅動的轉錄程序如何決定不同譜系中的神經元亞型分化，并鑒定了調控譜系分化的關鍵轉錄因子。這項研究不僅闡明了皮質和皮質下區域神經元群體生成的調控機制，還為GABA能神經元相關疾病的發病機制提供了轉錄組學層面的新見解。

單細胞RNA測序

（技術服務由伯豪生物提供）

1. 神經節隆起條件性敲除Foxg1驅動GABA能神經元向皮質遷移

為探究GE來源的GABA能神經元的發育機制。作者通過條件性敲除Foxg1，發現Foxg1缺失導致GABA能神經元在E16.5和E18.5階段異常聚集在皮質下區，而在大腦皮質和嗅球（OB）中的分布顯著減少，表明Foxg1缺失影響了神經元從GE向皮質和嗅球的遷移。單細胞RNA測序分析E16.5階段的GE細胞群，發現Foxg1條件性敲除導致MGE來源的LHX6^high皮質中間神經元（CINs）比例顯著降低，而紋狀體中間神經元（SINs）和蒼白球典型神經元比例增加。免疫染色證實了SST+中間神經元在腹側前腦異常聚集。研究還意外發現一類表達NKX2-1的紋狀體投射神經元（SPNs）新亞型，具有典型的SPN分子特征（Meis2、Foxp1/2高表達），并通過譜系追蹤實驗證實這些神經元確實來源于MGE而非傳統認為的腹側LGE。

2. LHX6^high CIN 向蒼白球的轉化開始于 Foxg1^cKO MGE 譜系的前體階段

為深入解析Foxg1敲除對MGE譜系神經元的影響，作者對單細胞數據做了進一步分析。RNA速率分析揭示了對照組MGE神經元譜系兩條主要發育軌跡：一條從祖細胞經共同前體狀態分化為LHX6^high CINs、SINs和GP典型神經元；另一條則較早地從祖細胞分化為NKX2-1⁺ SPNs。Foxg1敲除導致LHX6^high CINs的發育軌跡明顯向SINs和GP神經元方向偏移。共同前體細胞（C0）再聚類分析，發現Foxg1敲除導致前體細胞的轉錄因子表達譜發生顯著改變：促CIN分化的Zeb2和Cux2下調，而促腹側神經元分化的Nkx2-1和Lhx8上調。Nkx2-1下游靶標Lhx6在前體細胞中表達升高，暗示腹側神經元命運增強。定量分析顯示，Foxg1敲除小鼠中pre-CINs比例急劇下降，而pre-SINs/pre-GP神經元比例顯著增加。以上結果表明，Foxg1缺失通過改變前體細胞的轉錄程序，促使MGE譜系神經元從皮質CINs向腹側SINs和GP神經元轉變。

3. FOXG1驅動的轉錄程序指導 MGE 譜系中 LHX6^high CIN與SIN/GP原型神經元的命運選擇

為進一步探究Foxg1調控MGE譜系神經元發育的分子機制，通過RNA 速率分析，作者繪制了對照組MGE譜系神經元亞型的完整發育軌跡，并鑒定出各軌跡中表達變化最顯著的500個基因。研究發現，LHX6^high CINs軌跡中Nkx2-1和Lhx8表達下調，而Cux2、Tcf4等皮質命運相關基因上調；SINs和GP神經元軌跡則呈現相反模式，其中Dach1和Pbx3分別特異性上調（圖3b）。

作者采用非負矩陣分解（NMF）方法，從對照組MGE譜系中定義了8個基因模塊，鑒定出56個調控神經元命運的關鍵轉錄因子（如Tcf4、Dlx2、Zeb2），其中86%受FOXG1直接或間接調控（圖3d）。為驗證這些發現，作者選擇關鍵模塊中的Sox4進行功能驗證，發現在E12.5過表達Sox4能顯著增加E16.5時皮質LHX6⁺ CINs的比例，這與Foxg1 cKO中Sox4下調導致CINs減少的表型相反，證實了Sox4促進皮質命運的作用（圖3e）。

這些結果共同表明，Foxg1通過直接調控核心轉錄因子網絡（如Sox4、Tcf4等），動態平衡皮質與腹側命運相關基因的表達，從而精確指導MGE譜系神經元的分化選擇。

4. 在dLGE/CGE譜系中，ID3^high OBIN 向GP Arkypallidal 神經元轉化，SP8^high OBIN/PROX1^high CIN 向杏仁核神經元轉化

為了深入解析Foxg1 cKO對dLGE/CGE譜系神經元發育的調控機制，作者通過發育軌跡分析，發現dLGE/CGE細胞存在兩個獨立的發育譜系：FOXP2^highSP8^low譜系（產生ID3^high OBINs和GP Arkypallidal神經元）和FOXP2lowSP8^high譜系（產生SP8^high OBINs、PROX1^high CINs和杏仁核神經元）。免疫染色證實SP8與FOXP2在dLGE/CGE細胞中呈現互補表達模式（圖4a）。在FOXP2^highSP8^low譜系中，ID3^high OBINs的發育軌跡明顯向GP Arkypallidal神經元偏移，其發育分支縮短而GP神經元分支延長（圖4c,d）；在FOXP2lowSP8^high譜系中，OBINs/CINs分支縮短而杏仁核神經元分支延長，表明SP8^high OBINs和PROX1^high CINs轉向杏仁核神經元命運（圖4c,d）。這些發現表明FOXG1和下游轉錄程序指導dLGE/CGE譜系中的命運選擇。

5. FOXP2^highSP8^low和FOXP2^lowSP8^high dLGE/CGE 譜系中指定每種神經元類型的獨特轉錄程序

隨后作者進一步揭示了FOXP2^highSP8^low和FOXP2^lowSP8^high dLGE/CGE 譜系中的發育機制。分別鑒定各神經元亞型發育過程中表達變化最顯著的500個基因（圖5a,b），在FOXP2^highSP8^low譜系中，ID3^high OBINs和GP Arkypallidal神經元在命運決定關鍵期表現出顯著差異：ID3^high OBINs特異性上調Id2、Hivep3等轉錄因子和Tcf4、Erbb4等遷移相關基因（圖5a）；而GP Arkypallidal神經元則選擇性上調Tshz2并維持Prox1表達。FOXP2^lowSP8^high譜系中，SP8^high OBINs、PROX1^high CINs和杏仁核神經元在發育中后期呈現明顯差異：SP8^high OBINs激活Tshz1；PROX1^high CINs中Nfix、Htr3a等皮質中間神經元特征基因表達上調；杏仁核神經元則特異性表達Wls等標記物（圖5b）。

通過整合差異基因和CUT&Tag數據，作者在FOXP2^highSP8^low譜系中鑒定出343個關鍵差異表達基因，其中34%為FOXG1直接靶標（圖5c）。這些基因可分為三類：111個ID3^high OBINs特異性基因（如下調的Tcf4、Epha4）、113個GP Arkypallidal神經元特異性基因（如上調的Meis2、Tshz2）以及119個共有基因。NMF分析進一步揭示34個核心轉錄因子構成調控網絡，其中88%受FOXG1調控（圖5e）。Meis2作為FOXG1直接靶標，其上調與腹側GP神經元增加顯著相關。在FOXP2^lowSP8^high譜系中，研究鑒定出調控SP8^high OBINs/PROX1^high CINs與杏仁核神經元命運分化的46個關鍵轉錄因子（圖5f），包括Etv1、Nr2f2等已知因子及St18、Hmgb1等新發現調控因子，其中85%（39個）受FOXG1調控。功能驗證實驗顯示，在E12.5過表達Hmgb1能顯著增加E16.5時皮質PROX1+ CINs的比例（圖5g），與Foxg1 cKO中Hmgb1下調導致CINs減少結果一致。

這些發現共同表明，Foxg1通過差異調控兩個譜系的轉錄程序：在FOXP2^high譜系中平衡Id2/Hivep3與Meis2/Tshz2的表達決定OBINs/GP神經元命運；在FOXP2^low譜系中通過Hmgb1等因子調控皮質與腹側神經元的分化選擇。

6. Foxg1調控皮質/皮質下區GABA能神經元發育的統一機制

通過整合MGE和dLGE/CGE譜系的差異表達分析，作者鑒定出40個共同調控因子（包括Tcf4、Prox1等19個FOXG1直接靶標），其中32個與自閉癥、精神分裂癥等神經精神疾病相關（圖6a,b）。作者選擇自閉癥相關基因Tcf4進行深入解析：熒光素酶實驗證實FOXG1直接激活Tcf4啟動子（圖7b）；在Foxg1 cKO中恢復Tcf4表達能顯著增加皮質PROX1⁺ CINs的數量（圖7c）。這些結果不僅證實Tcf4是FOXG1調控神經元命運的關鍵效應分子，更揭示了神經精神疾病風險基因如何通過干擾GABA能神經元命運決定參與病理過程。

參考文獻：

[1] Sun L, Xiong F, Huang F, Dong S, Zhu P, Jiang P, Zhang B, Zhang X, Sun J, Peng H and Zhao C 2025 Transcriptomic insights into fate choice of pallial versus subpallial GABAergic neurons Nat Commun 16 5032