nature｜巨噬細胞的“細菌營養餐”：代謝回收如何為免疫反應“供能”

英文標題：Macrophages recycle phagocytosed bacteria  to fuel immunometabolic responses

中文標題：巨噬細胞對吞噬的細菌進行回收利用以促進免疫代謝反應

發表期刊：nature

影響因子：48.5

巨噬細胞作為免疫系統的關鍵組成部分，通過吞噬作用清除入侵的微生物是其核心功能之一。這一過程中，巨噬細胞會將細菌等病原體內化至吞噬體，并與溶酶體融合形成吞噬溶酶體，通過酶解等作用降解病原體。然而，長期以來，對于吞噬后細菌降解產物的具體代謝去向，以及這些產物如何影響巨噬細胞自身的代謝活動和免疫功能，學界的認知仍較為有限。

已知營養物質不僅是細胞能量和生物合成的基礎，還能調控免疫細胞的激活、功能與分化，而巨噬細胞憑借其強大的吞噬能力，可能具備通過替代途徑獲取營養以驅動代謝的潛力。同時，巨噬細胞在識別微生物后，會通過模式識別受體(PRRs)啟動免疫信號通路，進而重組細胞內代謝途徑，使免疫反應強度和特異性與所遭遇的威脅相匹配。但細菌的活力是否會影響這一過程，以及背后存在怎樣的調控機制，尚未得到充分闡明。因此，探究巨噬細胞對吞噬細菌的代謝利用方式，及其與細菌活力相關的調控機制，成為理解免疫代謝交叉調控的重要方向。

1、細菌的吞噬作用為線粒體供能

為探究細菌吞噬是否能為巨噬細胞提供營養，研究對比了滅活無毒革蘭氏陰性大腸桿菌(KEC)刺激與脂多糖(LPS)激活TLR4后巨噬細胞的代謝重編程差異：

• 基因表達差異：兩種刺激下，骨髓來源巨噬細胞(BMDMs)的炎性細胞因子(IL-6、TNF、IL-1β)產生及ERK1/2磷酸化水平相似，但刺激4小時后RNA測序顯示約1200個基因差異表達，KEC處理組中與代謝過程和代謝物膜轉運蛋白相關的基因高表達（圖1a-b），且溶質載體(SLC)家族氨基酸轉運蛋白基因的差異表達使其具有特定表達譜（圖1c），表明完整細菌的攝取與LPS單獨激活TLR4引發的代謝及營養處理通路重編程不同。

• 線粒體相關基因調控：在MitoCarta數據庫的1140個線粒體蛋白編碼基因中，74個差異表達基因使KEC刺激的巨噬細胞呈現特定線粒體基因特征，推測被吞噬的KEC可為線粒體氧化磷酸化提供營養。

• 代謝指標驗證：

• 在含葡萄糖的“呼吸培養基”中，KEC組和LPS-微球組均使細胞外酸化率(ECAR)升高（圖1d），且LPS和KEC誘導的ATP濃度相似，提示模式識別受體(PRR)激活后糖酵解通量被誘導以滿足能量需求。

• 與其他組相比，KEC顯著提高氧消耗率(OCR)（圖1d），而損害吞噬體成熟會阻止該誘導（圖1e）。

• 盡管LPS和KEC處理組的氨基酸濃度相似，但非必需氨基酸(NEAAs)與LPS聯合添加可使OCR升高至類似KEC處理的水平（圖1f），單獨添加絲氨酸等與LPS聯合也能誘導OCR，支持吞噬溶酶體降解KEC可通過提供包括氨基酸在內的營養為線粒體代謝供能的假設。

2、被吞噬的細菌提供代謝中間體

為探究巨噬細胞對吞噬細菌降解產物的利用情況，研究通過系列實驗得出以下結論：

• 細菌來源氨基酸參與蛋白質合成：采用穩定同位素標記氨基酸培養技術(SILAC)標記滅活大腸桿菌(SILAC-KEC)，與巨噬細胞共培養后發現，直接接觸時可檢測到含¹³C標記精氨酸或賴氨酸的巨噬細胞特異性肽段，Trans-well分離時則無（圖2b）。延長共孵育時間未增加此類肽段，提示細菌來源氨基酸在吞噬后迅速整合，可能在巨噬細胞激活后受抑。51種含細菌來源氨基酸的蛋白質在所有時間點均存在，主要與先天免疫反應或糖酵解等代謝途徑相關，且多數豐度隨時間增加。用v-ATPase抑制劑伴胞霉素A破壞吞噬體成熟后，巨噬細胞內多種氨基酸濃度降低，含¹³C標記的精氨酸或賴氨酸肽段數量顯著減少（圖2c），表明吞噬溶酶體對KEC的降解是氨基酸回收用于新蛋白質合成的必要條件。

• KEC提供廣泛代謝中間體：在僅含Uniformly ¹³C標記葡萄糖的培養基中培養大腸桿菌，得到標記的U-[¹³C]-KEC，處理巨噬細胞后發現，細胞與細菌直接接觸時，KEC來源的¹³C大量摻入巨噬細胞代謝物，Trans-well分離時則無（圖2e）。三羧酸循環代謝物和非必需氨基酸中¹³C顯著摻入，必需氨基酸中未檢測到（圖2f），且衣康酸中¹³C富集，其摻入依賴細胞與細菌直接接觸（圖2f）。

• 體內及跨細菌種類的代謝回收：向小鼠腹腔注射DAPI標記的U-[¹³C] KEC，兩小時后分選的DAPI?吞噬細胞中¹³C摻入代謝物明顯（如谷氨酸、谷胱甘肽同位素體），DAPI?細胞中不明顯（圖2g）。吞噬U-[¹³C] KEC的細胞中檢測到含¹³C代謝物，吞噬未標記KEC的細胞中則無，表明吞噬細胞在體內可代謝回收死細菌。此外，巨噬細胞吞噬Uniformly ¹³C標記的其他滅活革蘭氏陰性菌和陽性菌后，均有細菌來源¹³C摻入多種代謝物（圖2h），說明其代謝吞噬細菌的能力不限于大腸桿菌。

綜上，吞噬死細菌可作為營養來源，其代謝物能被回收利用到巨噬細胞代謝中。

3、RagA調控被攝入細菌的回收利用

研究探究了調控巨噬細胞對KEC降解產生的微生物源營養物質回收利用的機制，重點關注了RagA和mTORC1通路的作用：

細胞中mTORC1通路可感知溶酶體氨基酸并調節代謝物流出，其激活與Rag GTPases相關。研究發現，Ras依賴性信號通路對KEC代謝回收無顯著影響，但共聚焦成像顯示30分鐘后RagA和mTOR定位于含熒光脂多糖微球的吞噬溶酶體（圖3a-b），且KEC激活mTORC1通路的效率不及LPS（圖3c）。

通過轉基因和敲除小鼠模型實驗，發現RagA^GTP/△巨噬細胞中mTORC1組成型激活，導致KEC來源的氨基酸攝取利用減少、代謝物回收降低（圖3d-e）；而RagA缺陷型巨噬細胞中，含¹³C標記的代謝物增多（圖3f），表明RagA或mTORC1通路調控著細菌來源營養物質的去向。

此外，mTORC1還關聯著代謝物回收與巨噬細胞代謝重編程。參與谷胱甘肽(GSH)生物合成的代謝物在LPS和KEC處理組中存在差異，且其產生與吞噬溶酶體對細菌的處理相關。RagA^GTP/△巨噬細胞中GSH合成相關代謝物濃度及細菌來源¹³C摻入量更低（圖3g-i），而RagA缺陷型巨噬細胞則相反（圖3j-k）。

綜上，RagA作為代謝調節因子，將吞噬溶酶體的營養感知與針對死細菌吞噬的谷胱甘肽生物合成相聯系。

4、微生物的存活狀態驅動代謝回收

研究探究了微生物存活狀態對巨噬細胞代謝重編程及內化微生物回收利用的影響：

專業吞噬細胞可區分活微生物與滅活微生物，雖巨噬細胞對大腸桿菌(EC)和滅活大腸桿菌(KEC)的吞噬與降解程度相似，但主成分分析顯示兩者刺激后的巨噬細胞代謝存在顯著差異（圖4a）。KEC處理組中谷胱甘肽(GSH)代謝是富集程度最高的通路，相關代謝物（如GSH、氧化型谷胱甘肽(GSSG)）更豐富，且衣康酸產生更多、活性氧(ROS)水平更低（圖4b-e），這種代謝特征會持續存在，且源于代謝通量和營養處理通路重塑而非相關基因轉錄重編程。

對細菌存活狀態的識別會調節巨噬細胞對微生物碳的整合能力。吞噬滅活的U-[¹³C]大腸桿菌(KEC)的巨噬細胞中，完全標記的代謝物更少，而同位素體比例更高（圖4f），表明KEC是更好的代謝中間產物提供者。RagA組成型激活會降低KEC刺激下細菌來源¹³C的回收率。

在營養匱乏條件下，吞噬EC會顯著降低巨噬細胞活力，而KEC可提供額外營養維持其活力（圖4g）。KEC通過提供代謝中間產物抑制ROS產生，其誘導的細菌來源¹³C在衣康酸及GSH合成相關氨基酸中摻入量更高（圖4h）。此外，向EC刺激的巨噬細胞培養基添加氨基酸，可將IL-1β產生減少至KEC處理組水平（圖4i）。

綜上，雖活細菌和滅活細菌均可作為營養來源，但滅活細菌來源的碳能更有效整合，支持巨噬細胞在惡劣環境中的活力，并維持如GSH生物合成等特異性代謝途徑。

5、環磷酸腺苷(cAMP)是微生物死亡的一種代謝信號

研究探究了調控被吞噬細菌代謝回收的信號及相關代謝反應，發現環磷酸腺苷(cAMP)和AMPK–mTORC1軸的關鍵作用：

代謝組學分析顯示，cAMP在滅活大腸桿菌(KEC)中特異性積累，是細菌死亡的代謝標志（圖5a）。巨噬細胞吞噬KEC后，cAMP轉化為AMP，其細胞內完全¹³C標記的AMP濃度高于吞噬活大腸桿菌(EC)的細胞（圖5b）。核苷合成途徑的代謝物（如AMP）摻入KEC來源碳最多，且KEC能維持AMP庫，而EC會特異性減少AMP庫（圖5c-d），同時EC和KEC對ATP庫的誘導作用相似（圖5e）。

KEC可激活AMPK（使AMPKα亞基Thr172磷酸化）并抑制mTORC1（降低其靶標磷酸化水平），該過程在刺激后30分鐘即發生（圖5f）。激活AMPK或抑制mTORC1，能使EC刺激的巨噬細胞活性氧(ROS)產生、IL-1β分泌降至KEC處理組水平，且RagA敲除會增加衣康酸產生（圖5g）。

綜上，cAMP是細菌死亡的代謝信號，KEC通過提供AMP激活AMPK并抑制mTORC1，二者共同調控巨噬細胞對細菌存活狀態的特異性免疫代謝反應。

本研究圍繞巨噬細胞對吞噬細菌的代謝利用機制展開，揭示了多個關鍵過程與調控信號。研究發現，巨噬細胞可通過吞噬作用攝取滅活細菌（如KEC）的降解產物，將其中的氨基酸整合到蛋白質合成中，且這一過程依賴吞噬溶酶體的降解功能；RagA/mTORC1通路在此過程中起調控作用，RagA激活會抑制細菌來源營養物質的回收利用，而其缺陷則促進該過程，并影響谷胱甘肽等抗氧化相關代謝物的生成。

同時，細菌存活狀態對巨噬細胞代謝重編程影響顯著，滅活細菌相比活細菌能更高效地為巨噬細胞提供代謝中間產物，支持其在營養匱乏環境中的活力，增強抗氧化反應（如產生更多GSH和衣康酸、降低ROS水平）并調節炎癥因子分泌。此外，環磷酸腺苷(cAMP)是細菌死亡的代謝標志，在巨噬細胞吞噬后轉化為AMP，通過激活AMPK、抑制mTORC1，參與調控巨噬細胞對細菌存活狀態的特異性免疫代謝反應。這些發現為理解巨噬細胞的營養利用與免疫代謝調節機制提供了重要見解。