我們做科研的，大多數人都養過細胞，細胞樣本實驗周期短，成本低，我們在養細胞的時候不可避免的要用到培養基，比如微生物用到的LB, M9等，動物細胞用到的DMEM等，每種培養基的成分都不盡相同，那么你有沒有考慮過，培養基是如何給細胞提供營養的呢？那些C源N源到底是怎么維持細胞生長的呢？我們今天要分享的這篇文獻，就以谷氨酰胺為例，使用同位素追蹤的方法給大家展示在缺氧條件下，谷氨酰胺作為C源是如何維持腫瘤細胞生長的。

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文章的研究背景是腫瘤細胞在缺氧條件下會以谷氨酰胺為C源，來研究谷氨酰胺的代謝途徑。

下面我們來解讀一下這篇文章

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當然了，先證明谷氨酰胺對細胞生長是很重要的，再來研究他的代謝，沒毛病

首先用添加了不同濃度、不同成分的培養基（Glu，AUCG，各種氨基酸）培養腫瘤細胞，發現培養基中若沒有谷氨酰胺，細胞死亡率會顯著上升，而添加了AUCG的培養基可以在谷氨酰胺缺失的情況下抑制細胞的死亡，說明谷氨酰胺與核苷的合成有關。由此，作者推論，谷氨酰胺是細胞生長所必須的物質。

那么在缺氧條件下細胞會將谷氨酰胺作為C源維持生長，但是谷氨酰胺也是生物體的N源，那么細胞會如何處理隨之而來的高濃度的N呢？

在缺氧條件下谷氨酰胺被用來做為主要的C源，尤其是脂質合成。

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由上圖b可知缺氧條件下細胞對谷氨酰胺（Gln）吸收增加了。通過13C-Gln標記發現脂質前體Ac-CoA增加了（圖c，m+0減少，m+2增加），其他下游物質如氨基酸等也增加了（圖d，e）。這些數據表明缺氧時谷氨酰胺作為C源吸收增加了。接下來，作者試圖找到谷氨酰胺的N代謝。谷氨酰胺可以脫去氨基生成NH3，但是對培養基的檢測發現NH3的量沒有升高反而下降了（圖f），NH3可以被代謝成尿素，但是培養基中尿素的含量卻下降了（圖g），因此谷氨酰胺的N應該是被其他物質利用了。

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通過在缺氧條件下的含N代謝物的篩選，得到了6個顯著升高的物質，11個顯著下降的物質。其中，五個顯著上調的物質：IMP、DOHA、OA、鳥嘌呤和肌苷參與了nucleotide biosynthesis通路，驗證結果也表明在HeLa、MCF-7和4T1細胞中IMP（AMP和GMP的前體）、carbamoyl-Asp、DHOA、OA都顯著升高。這些結果表明缺氧導致細胞內核苷酸的前提累積，尤其是嘧啶前體，包括carbamoyl-Asp、DHOA和OA。

· 缺氧條件下谷氨酰胺的N富集在DOHA和OA上

作者使用N15標記的谷氨酰胺來追蹤N的吸收。由上圖可知，酰胺基（Amine）上的N會轉移到Asp、DOHA、OA、UMP、IMP上，而氨基（Amide）上的N會轉移到DHOA、OA、UMP、IMP上。

在缺氧條件下，標記的DHOA和OA含量顯著上升，說明谷氨酰胺的N富集于DHOA和OA上，但是DHOA和OA的代謝效率不高，因為下游產物UMP含量沒有增加。

標記的N還可以在氨基酸中檢測到，但是在缺氧條件下，被標記的氨基酸含量都沒有升高，因此這些數據可以證明缺氧條件下谷氨酰胺的N富集于DHOA和OA上而不是氨基酸上。

· 缺氧條件下促使天冬氨酸作為嘧啶前體

由上圖可知，谷氨酰胺的C在通過TCA循環和α-酮戊二酸羧化還原途徑轉移到天冬氨酸之后可以被合成為嘧啶。這兩條途徑可以通過檢測C13-Gln來源的乙酰輔酶A，天冬氨酸，檸檬酸，DHOA和OA來區分。正常條件下，谷氨酰胺的C進入TCA循環，可以生成M+4的Asp，檸檬酸，DHOA和OA；在缺氧條件下，生成m+2的乙酰輔酶A，m+3的天冬氨酸，m+5的檸檬酸，m+3的DHOA和OA通過還原途徑生成；m+3的UMP可以由兩條途徑都生成。

由上圖結果可知缺氧條件下谷氨酰胺的C通過還原途徑進入了乙酰輔酶A、DHOA和OA，并且含量有所升高，因此缺氧條件促進了他們的合成。但DHOA的直接前體：天冬氨酸含量卻降低了，這可能與嘧啶合成通路中多個酶參與有關，為研究這個現象，作者使用C13,15N-Asp來追蹤天冬氨酸在嘧啶合成中的代謝。

由上圖可知，檢測到了m+5的Asp表明細胞完全可以吸收外源的13C-15N-Asp（圖a），也檢測到了15N-m+1的谷氨酸和天冬氨酸，13C-m+4的天冬氨酸（圖a，b）；缺氧使細胞吸收更多的天冬氨酸，有趣的是，正常條件下細胞并不能產生很多的DHOA和OA, 但是在缺氧條件下DHOA和OA的含量都升高了（m+4，m+5顯著升高），而且m+4的天冬氨酸生成m+5的DHOA和OA效率更高了，因此缺氧使天冬氨酸到DHOA和OA的途徑活性升高了，這也導致細胞內的天冬氨酸含量降低。

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· DHOA和OA是細胞生長必須的嗎？

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從上述結果來看，缺氧條件下大部分的谷氨酰胺都生成了DHOA和OA，那么他們對細胞生存是必須的嗎？作者對DHOA和OA通路上的酶做了knockdown，如CAD、DHODH、GOT1。

DHODH和CAD是嘧啶合成的關鍵酶，因此他們的knockdown即使在正常條件下也明顯的影響了細胞的分化。相反的是，缺氧條件下，GOT1的敲除輕微地影響了細胞的分化。而CAD和GOT1的敲除讓細胞無法生長，DHODH的敲除只是稍微影響細胞的生長。這說明對于細胞來說，DHOA才是不可缺少的，而不是OA。

CAD和GOT1的敲除顯著降低了DHOA和OA的含量（圖e，f），同時也減少了α-酮戊二酸，檸檬酸和乙酰輔酶A的含量（圖g）。雖然天冬氨酸可以合成DHOA和OA，外源添加天冬氨酸也并沒有使DHOA和OA的量增加（圖e，f）。這些數據說明谷氨酰胺的C代謝和N代謝都與DHOA有關。

為了確認這個假設，使用α-酮戊二酸（C來自谷氨酰胺）處理細胞，結果顯示α-酮戊二酸的添加可以減少谷氨酰胺的吸收（圖d），幾乎完全清除了DHOA和OA的積累（圖h，i），并且抑制了DHOA的分泌（圖j）。尿苷和α-酮戊二酸的添加可以使敲除酶的細胞增值增加，但是單獨添加尿苷不能，單獨添加α-酮戊二酸或添加α-酮戊二酸和尿苷可以升高細胞的增殖，這些結果表明谷氨酰胺的C代謝對細胞生長來說是必要的，并且取決于DHOA的合成。

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通過同位素追蹤，文章展示了一條在缺氧條件下的谷氨酰胺通路，找到了缺氧條件下腫瘤細胞中的代謝變化，找到了谷氨酰胺的代謝產物DHOA和OA, 并在病人和小鼠中也檢測到了升高的DHOA和OA，因此他們可以作為腫瘤的潛在標志物，通路上的酶如CAD和GOT1可以作為腫瘤治療的可能目標。

怎么樣，代謝流的結果是不是很強大呢？

它可以為我們提供更直接的證據來說明問題，在基因工程和不同環境或不同代謝途徑中找到關鍵通路及代謝功能變化方面提供強有力的證據。

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