淋巴細胞受體在有頜和無頜脊椎動物中獨立進化，具有相似的適應性免疫反應。然而，與有頜動物相比，無頜脊椎動物淋巴細胞的功能亞型和分子結構的多樣性尚未得到很好的界定。作者用scRNA-seq分析了七鰓鰻（Lampetra morii）的鰓、腸和血液，并使用全長轉錄組作為參考。研究結果顯示，與B樣細胞相比，T樣細胞具有更高的組織特異性異質性。作者鑒定出一種獨特的T樣細胞亞型，表達非淋巴細胞造血生長因子受體的同源物MPL-L。這些MPL-L+ T樣細胞表現出與下顎脊椎動物的T細胞不同的特征，特別是造血基因的表達升高。進一步發現MPL-L+VLRA+ T樣細胞廣泛存在于七鰓鰻的斑目魚、鰓、肝臟、腎臟和皮膚中，它們在T細胞有絲分裂原和重組人血小板生成素的作用下增殖。這些發現為無頜脊椎動物的適應性免疫反應提供了新的見解，為適應性免疫的進化提供了新的思路。

scRNA-seq

1. L.Mori幼蟲的多免疫組織細胞圖譜

無頜和有頜脊椎動物的適應性免疫系統（AIS）由獨特的淋巴樣受體系統支撐。作者利用了L. morii的全長轉錄組進行進一步的單細胞RNA測序數據分析。結果證明了基因信息全長轉錄組提供的數據足以支持后續分析。

為了研究七鰓鰻免疫組織中細胞類型的多樣性，從三種組織類型中采集了單細胞樣本：鰓、血液和腸（包括腸系膜），并制備了六個鰓文庫、三個血液文庫和五個腸文庫。保留了25,978個鰓細胞、16,483個血液細胞和23,204個腸細胞用于進一步分析，中位數分別為590、489和873。根據ALAS1和CD45，區分了紅細胞和免疫細胞群體。根據VLRA、VLRC和VLRB基因的表達情況，進一步區分了T樣細胞和B樣細胞。首先注釋了鰓的細胞圖譜，重點是通過先前文獻識別髓系細胞群體以及差異表達基因的分析。值得注意的是鑒定出一個特定的細胞群體，其特征是表達多種干擾素刺激基因（ISGs），包括MX1、TRIM25/29/80、TRIM65等。這種表達模式表明這些ISGs表達細胞對干擾素信號具有獨特的反應。還鑒定出一個造血細胞群體（TAL1、ITGB3、PMP22等），上述標志基因也被用于后續腸道和血液圖譜的注釋過程。

2. 組織間的細胞異質性

為了更好地比較鰓、血液和腸道中細胞類型的差異，整合并聚類了這些細胞類型，包括紅細胞、表達ISGs的細胞、造血細胞、內皮細胞、成纖維細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞/DC細胞、上皮細胞、T細胞和B細胞。紅細胞和淋巴細胞的比例高于其他三種組織中的其他細胞類型。腸道中的先天免疫細胞濃度相對鰓和血液更高。使用抗VLRA pAb的免疫組化方法鑒定鰓絲和鰓片中的VLRA+細胞。結果顯示，在所有研究的組織中均觀察到大量棕色陽性信號。

進一步進行了MetaNeighbor分析，以探究三種組織之間的細胞類型關系。ISG表達細胞、造血細胞和紅細胞在鰓和腸中表現出相似的特征，在這三種不同的組織中顯示出相同的表達模式。在B細胞中觀察到了顯著的跨組織相似性，但在T細胞中未見此現象。B細胞的基因表達譜表現出顯著的一致性。在所有三種組織中均存在。然而，某些T細胞標志物和差異表達基因的表達譜顯示了顯著異質性，這可歸因于T細胞亞型的組織特異性分化。

3. 不同淋巴細胞亞型的發現和表征

重新整合并分析了T細胞和B細胞。根據差異基因表達譜，鑒定出五種T細胞亞型和一種B細胞群體。通過分析特征基因，發現大多數T細胞亞型高度表達了與傳統T細胞功能相似的基因。MPL-L⁺T細胞的標志性基因與造血有關。MPL-L基因在MPL-L⁺T細胞中高度且廣泛表達，并與VLRA共表達。有趣的是，MPL是頜類脊椎動物中的一種非淋巴系造血生長因子受體，主要與其配體血小板生成素（TPO）結合，參與造血干細胞（HSCs）的自我更新和巨核細胞衍生血小板的成熟，但不參與淋巴細胞的發育和激活。同時，MPL能夠激活一系列信號傳導途徑，包括JAK/ STAT磷酸化途徑和RAS途徑。然而，目前的小鼠研究表明，通過轉基因技術將MPL基因引入T細胞可以增強T細胞的自我更新能力和抗腫瘤能力，這基于TPO-MPL信號傳導途徑與T細胞激活過程中共刺激分子和細胞因子產生的共同信號通路重疊。基于觀察到的轉錄異質性和獨特的分布模式，作者認為MPL-L⁺T細胞構成了七鰓鰻淋巴細胞譜系中的一個非常規群體。

4. MPL-L⁺T細胞代表了無頜脊椎動物適應性免疫系統的一個獨特方面，與有頜脊椎動物不同

SAMap分析結果顯示，七鰓鰻與斑馬魚和小鼠之間在先天免疫細胞和造血細胞/造血干細胞/巨核細胞方面存在廣泛的共識。B細胞與小鼠中的B細胞相似度較低，而斑馬魚中則表現出明顯的B細胞一致性。在七鰓鰻T細胞譜系的跨物種映射中，結果顯示出復雜的關系。作者分析了斑馬魚/小鼠和七鰓鰻中mpl/Mpl/MPL-L基因的分布和表達。結果顯示，絕大多數MPL-L⁺ T樣細胞和造血細胞在七鰓鰻中表達MPL-L基因，而在斑馬魚/小鼠中僅HSCs/巨核細胞表達該基因。

為了驗證MPL-L⁺T樣細胞是否僅存在于七鰓鰻中，作者對斑馬魚的多個器官（肝臟、頭腎、胸腺和鰓）進行了原位雜交和共定位分析。結果顯示，mpl并未與T細胞標志物lck共定。作者還制備了抗Lm-MPL-L多克隆抗體，并通過免疫熒光檢測了七鰓鰻中MPL-L與VLRA之間的共定位。觀察到MPL-L和VLRA在鰓絲、皮膚、腎臟和肝臟中共定位。基于這些結果，表明了七鰓鰻T細胞的潛在激活信號以及脊椎動物中淋巴細胞譜系的進化分化。

5. MPL-L⁺ VLRA⁺細胞對植物血凝素-L（Pha-L）和重組人TPO（rhTPO）的反應

為了進一步驗證MPL-L⁺ VLRA⁺細胞是否具有T細胞抗原反應特征并對人TPO有響應，作者對尾蚴進行了腹腔注射PHA-L和rhTPO。免疫熒光檢測結果顯示，PHA-L和rhTPO的刺激導致VLRA和MPL-L共定位區域增加，并促進了MPL-L在腸系膜中的表達。結果還顯示，注射后鰓絲中MPL-L⁺ VLRA⁺細胞的比例增加。然而未觀察到鰓絲中MPL-L⁺ VLRA⁺細胞群體內MPL-L表達水平有顯著變化。此外，用抗VLRA和抗MPL-L染色的細胞流式細胞術分析顯示，rhTPO注射后MPL-L⁺ VLRA⁺細胞的比例增加。此外， PHA-L免疫刺激促進了VLRA⁺細胞和MPL⁺細胞的增殖。這種刺激可能促進分化過程早期或晚期階段的細胞增殖，這些細胞分別表達MPL-L或VLRA。EdU注射也顯示，在rhTPO注射后，鰓絲和鰓絲中細胞增殖增加。

6. MPL-L⁺T細胞的特征分子譜和發育軌跡

通過使用Monocle2推斷狀態軌跡，探索了T細胞亞群中的動態細胞轉變。根據軌跡信息，確定這一軌跡始于T細胞亞型3，最終大多數MPL-L⁺T樣細胞達到了與其他三個細胞亞群不同的終末狀態。計算了每個T樣細胞亞群中表達VLRA基因的細胞比例以及VLRA基因的平均表達量。觀察到表達VLRA基因的T細胞亞型3的比例較為溫和，且T細胞亞型3中VLRA基因的平均表達水平在所有T樣細胞亞群中最低。T細胞亞型2中VLRA基因的表達水平略高于T細胞亞型3，而T細胞亞型1和MPL-L⁺T樣細胞主要處于終末狀態。

腸道、血液和鰓中的MPL-L⁺T樣細胞群體通過差異表達基因得以區分。為了進一步確認MPL-L⁺T細胞在三種組織中的異質性，還利用Monocle 2軌跡分析來確定這些組織內MPL-L⁺T細胞的過渡狀態。結果顯示，這些細胞處于獨特的分化狀態。結合軌跡轉換信息和表達VLRA基因的細胞比例，推斷出MPL-L⁺T細胞在其各自組織中表現出轉錄和發育多樣性。在鰓、血液和腸道中MPL-L⁺T細胞的轉化過程中，形成了三種組織特異性基因表達模式。T細胞共刺激分子CD63和先天淋巴細胞譜系的標志性轉錄因子ZBTB16也在腸道中的MPL-L⁺T細胞中表達。

為了進一步研究MPL-L基因在不同組織中MPL-L⁺T細胞中的潛在作用及其調控機制，確定了三種MPL-L⁺T細胞亞群中表達MPL-L基因的細胞比例及該基因的平均表達水平，在三種組織中，MPL-L基因隨著MPL-L⁺T細胞的發展軌跡呈現出顯著上升的趨勢。證實MPL-L基因的表達與其下游基因JAK2和STAT5B在MPL-L⁺T細胞中呈正相關。腸道MPL-L⁺T細胞中的正相關關系比其鰓和血液中的更為明顯。這些發現表明，在MPL-L⁺T細胞內可能存在一個基于MPL-L的信號傳導系統，可能協調腸道MPL-L⁺T細胞的發育或激活。

參考文獻：

Huang Y, Liu X, Li S, Li C, Wang HY, Liu Q, Chen JY, Zhang Y, Li Y, Zhang X, Wang Q, Liu K, Liu YY, Pang Y, Liu S, Fan G, Shao C. Discovery of an unconventional lamprey lymphocyte lineage highlights divergent features in vertebrate adaptive immune system evolution. Nat Commun. 2024 Sep 3;15(1):7626. doi: 10.1038/s41467-024-51763-2. PMID: 39227584; PMCID: PMC11372201.