這篇文章探討了益生菌及其代謝產物亞精胺(Spermidine, SPD)如何增強IFN-γ⁺CD4⁺T細胞免疫反應以抑制乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)。全球約有2.96億人慢性感染HBV，這增加了肝硬化和肝細胞癌的風險，使HBV成為最嚴重的傳染病之一。世界衛生組織的目標是到2030年將HBV發病率減少95%，死亡率減少65%。理想的HBV抗病毒治療目標是實現功能性治愈，即持續抑制HBV DNA并使血清乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface Antigen, HBsAg)消失。然而，實現慢性HBV感染的功能性治愈是困難的，自然歷史成功率不到1%，即使長期治療，現有抗病毒藥物的成功率也不到5%。因此，恢復T細胞免疫和實現HBV感染的功能性治愈是研究的重點。

在5周齡的C57BL/6小鼠體內通過水動力注射(Hydrodynamical Injection, HDI)腺相關病毒/HBV1.2(AAV/HBV1.2)質粒制備了HBV攜帶者小鼠模型，從HDI前2周（BLE Pre組）或注射后3天（BLE組）開始，每天灌胃BLE（圖1A）。如圖1B-E所示，BLE和BLE Pre均能顯著抑制HBV復制，表現為血清HBsAg、HBV DNA以及肝臟前基因組RNA(pgRNA)和HBV RNA水平降低。與此一致的是，在注射后6周內，給藥BLE顯著降低HBsAg陽性小鼠的百分比(wpi)（圖1F）。

通過16S rRNA測序，研究者發現益生菌處理的小鼠腸道微生物組發生了顯著變化，包括Prevotellaceae、Clostridiaceae、Akkermansia和Ruminococcaceae等家族的富集（圖2C），這些家族被認為有助于通過抗PD-1或CTLA-4抗體恢復耗盡的CD8⁺T細胞。此外，益生菌處理的小鼠糞便中BLE（B. longum, L. acidophilus, 和E. faecalis）的豐度顯著增加（圖2D），表明益生菌在腸道中的積累。

收集PBS或BLE處理的HBV攜帶小鼠（供體小鼠）的糞便。使用受體小鼠進行FMT實驗，在5周齡時，用抗生素混合物(ABX)治療14天，然后用HBV HDI對其進行腸道消毒（圖2E）。如圖2F-2H所示，移植BLE小鼠糞便微生物群(FMT-BLE)可顯著促進受體小鼠對HBV的清除，與接受對照糞便微生物群(FMT-Control)的小鼠相比，血清HBsAg和HBV DNA水平明顯降低，肝臟pgRNA表達明顯降低。同樣，FMT-BLE小鼠中HBsAg陽性小鼠的百分比明顯低于FMT-Control小鼠（圖2I）。

為了進一步驗證BLE在HBV清除中的直接作用，引入無菌(GF)小鼠，通過HDI建立HBV模型，然后給予益生菌（圖2J）。與無特定病原體(SPF)小鼠的結果一致，添加BLE大大增加了GF小鼠糞便中BLE的數量（圖2K），降低了血清HBsAg、HBV DNA和肝臟pgRNA的水平（圖2L）。綜上所述，這些數據表明BLE的積累有助于小鼠的HBV清除。

進一步探究CD4⁺T細胞亞群在BLE介導的HBV清除中的作用（圖3D-L），RT-qPCR與FCM檢測顯示，BLE處理使小鼠肝臟Th1細胞相關轉錄因子和細胞因子表達上調，(T-bet)⁺Th1細胞增多。ELISA和FCM分析表明，肝臟勻漿IL-21、IFN-γ水平，以及Th1細胞中二者表達顯著增加。此外，BLE處理提升了脾臟CD8⁺T細胞IFN-γ產量，增加無菌小鼠肝臟和脾臟IFN-γ⁺CD4⁺T細胞數量。上述結果表明，給予BLE能夠使宿主通過增強CD4⁺Th1細胞中IL-21和IFN-γ的產生來清除HBV。

研究者發現，益生菌影響宿主的微生物代謝。通過飛行時間質譜聯用系統(GC-TOF-MS)檢測了BLE處理小鼠糞便中的代謝物變化。結果顯示，38種代謝物在對照組和BLE處理組小鼠之間存在顯著差異，其中包括亞精胺(SPD)（圖4A)。進一步的靶向代謝組學分析表明，SPD在BLE處理的小鼠肝臟中積累，并且其濃度高于腐胺(putrescine)。重要的是，亞精胺在BLE處理的GF小鼠的糞便、外周血清和肝臟中積累（圖4B），表明BLE產生的亞精胺可能通過血液循環從腸道轉移到肝臟。

采用傳統的細菌培養方法獲得培養上清并檢測SPD濃度。發現在含精氨酸的培養基中，培養的BLE在pH 5.0時產生的SPD水平明顯高于pH7.0（圖4C）。此外，給藥BLE在抗生素(ABX)處理小鼠的糞便、肝組織和血清中產生的SPD水平明顯較高，而單獨的糞腸桿菌在體外和體內都不能有效產生SPD（圖4C）。因此，BLE能有效地產生SPD并增強抗HBV免疫，糞腸桿菌能在長芽胞桿菌和嗜酸乳桿菌的協同下產生SPD。

進一步研究SPD在HBV清除中的作用。發現SPD單獨給藥可顯著降低HBV攜帶者小鼠血清HBsAg、HBV DNA和肝臟pgRNA水平（圖4D-4F）。綜上所述，這些結果表明，BLE來源的SPD通過外周循環從腸道積累到肝臟，這有助于小鼠的HBV清除。

研究者進一步探索了SPD介導的HBV清除背后的機制，包括腸道穩態和T細胞免疫。結果顯示，亞精胺喂養的小鼠顯示出腸道緊密連接蛋白表達的顯著增加，伴隨著血清FITC-葡聚糖和iFABP水平的明顯降低。此外，SPD喂養導致腸道IL-17A、IL-21和IL-22表達的顯著增加，以及腸道IL-17A⁺CD4⁺T細胞、IL-21⁺CD4⁺T細胞和IL-22⁺CD4⁺T細胞的百分比和MFI的增加。亞精胺還增強了HBV攜帶小鼠肝臟和脾臟中IL-21⁺CD4⁺T細胞和IFN-γ⁺CD4⁺T細胞的頻率（圖4G和4H），ELISA證實SPD小鼠肝臟勻漿中IL-21和IFN-γ水平顯著升高（圖4I），提示SPD增強了HBV攜帶者小鼠的CD4⁺T細胞免疫。

用有或沒有SPD的ovabumin(OVA323-339)肽刺激OT-II小鼠的體外脾細胞。FCM證實SPD以劑量依賴性方式增強ova刺激的OT-II CD4⁺T細胞中IFN-g的產生（圖5A）。同時，SPD劑量依賴性地促進了OT-II CD4⁺T細胞中自噬體的積累（圖5B），而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA, 1 mM)進一步增強了SPD誘導的自噬體積累（SPD+3-MA，圖5C），提示SPD處理的CD4⁺T細胞中自噬活化。值得注意的是，3-MA顯著降低SPD誘導的CD4⁺T細胞中IFN-g的增加（圖5D）。

SPD是真核翻譯起始因子5A(eIF5A)的唯一已知底物，elf5a通過選擇性翻譯調控tfeb蛋白表達。用GC7(SPD+GC7)（eIF5A的特異性抑制劑）處理，減少了SPD誘導的自噬體的積累（圖5C），并完全破壞了SPD誘導的IFN-γ在CD4⁺T細胞中的積累（圖5D）。與此一致的是，SPD誘導HBV攜帶者小鼠肝臟CD4⁺T細胞中的自噬體積累（圖5E）。更重要的是，SPD顯著促進了來自HBV患者外周血的CD4⁺T細胞中自噬體和IFN-γ的積累，而GC7的治療在很大程度上破壞了這種誘導（圖5F和5G）。綜上所述，這些數據表明SPD以自噬依賴的方式增強CD4⁺T細胞的功能。

為了評估益生菌在自然微生物組中是否會引起類似的改變，并評估BLE和亞精胺在HBV清除中的臨床治療潛力，研究者通過用HBV患者的糞便樣本重建GF小鼠的微生物群，構建了人類菌群相關(HFA)小鼠模型。結果顯示，BLE和SPD在HFA小鼠中顯示出顯著的HBV清除能力。與對照組相比，BLE/亞精胺處理的HFA小鼠血清HBsAg、HBV DNA和肝內pgRNA水平顯著降低（圖6B-D）。BLE和亞精胺顯著促進了肝內CD4⁺T細胞中自噬體的積累（圖6E），并增強了肝臟和脾臟CD4⁺T細胞中IFN-γ的產生（圖6F）。更重要的是，BLE和SPD都顯著增強了肝臟和脾臟HBV特異性CD4⁺T細胞中IFN-γ的產生，表明BLE和SPD對HBV特異性免疫的潛在貢獻（圖6G）。

對血清HBsAg持續低水平（低于2000 IU/mL）的HBV患者進行BLE聯合抗病毒治療的臨床效果進行了初步觀察，這些患者通常被認為是功能治愈的有利人群趨勢(圖6h)。與對照組相比，接受BLE治療6個月的患者血清HBsAg和HBeAg明顯下降（圖6I）。正如預期的那樣，補充BLE顯著促進外周血單核細胞(PBMCs)CD4⁺T細胞中自噬體的積累和IFN-γ的表達（圖6J和6K）。

基于SPD在T細胞激活和HBV清除中的作用，研究者進一步確定亞精胺是否能夠增強恩替卡韋(ETV)的治療效果。結果顯示，與ETV單藥治療相比，ETV和亞精胺的聯合治療組在HBsAg和pgRNA水平上顯示出更顯著地降低，同時對HBV DNA的抑制效果與單藥治療相當（圖7A-D）。

這項研究表明，益生菌和其代謝產物亞精胺通過自噬增強IFN-γ⁺CD4⁺T細胞免疫反應，有效促進HBV的清除。這些發現為使用益生菌和亞精胺與抗HBV藥物聯合治療慢性HBV感染提供了可能的治療線索。盡管這項研究在人類中的樣本量較小，但數據仍然顯示了益生菌在實現HBV功能性治愈方面的潛力。未來的研究需要通過前瞻性隨機對照試驗來驗證這些初步觀察結果，并進一步探索益生菌和亞精胺在HBV治療中的作用機制。